Курсовая работа: Получение ферментных препаратов выращенных глубинным способом

Далее в зависимости от свойств выделяемого фермента и сопутствующего ему балласта схема очистки и получения ферментного препарата может включать различные приемы и методы, такие, как концентрирование, диализ, осаждение органическими растворителями, солями, гель-фильтрование, афинная хроматография, иммобилизация, сушка термолабильных материалов и т. д. Поэтому рассмотрим этапы получения ферментных препаратов.

 

1.3.2 Технологическая схема получения очищенных ферментных препаратов

Схемы получения ферментных препаратов зависят от свойств выделяемого фермента и методов очистки, примененных для получения препарата нужной степени чистоты. В качестве примера рассмотрим технологическую схему получения препаратов из поверхностной и глубинной культур в виде жидких концентратов, сухих технических препаратов, получаемых сушкой распылением, и препаратов, осажденных органическими растворителями (рис. 2).

Фильтрат охлажденной культуральной жидкости собирается в основном сборнике и по мере надобности передается в сборник небольшой вместимости перед поступлением в подогреватель вакуум-выпарной установки пленочного типа. Концентрат культуральной жидкости с содержанием сухого вещества 6 – 10 % поступает в сборник концентрата. Для получения сухого технического препарата концентрат направляют в башню распылительной сушилки 8. Сухой препарат через циклон 10, бункер 11 и шнек 12 попадает на стадию стандартизации, фасования и упаковывания.

Рис. 2. Принципиальная технологическая схема получения очищенных препаратов из культур микроорганизмов, выращенных глубинным и поверхностным способами: 1 – сборник фильтрата культуральной жидкости; 2 – подогреватель вакуум-выпарной установки; 3 – сборник экстракта поверхностной культуры; 4 – конденсатор; 5 – сборник конденсата; 6 – вакуум-выпарной аппарат; 7 – сборник концентрата; 8 – распылительная сушилка; 9 – теплообменники; 10 – циклон; 11 – бункер для высушенного препарата; 12 – шнек; 13 – фильтр рукавный; 14 – осадитель; 15 – дозаторы; 16 – сепаратор; 17 – насос для спирта; 18 – мерник для спирта; 19 – смеситель промывки осадка спиртом: 20 – центрифуга; 21 – вакуум-сушилка роторная; 22 – бункер для высушенного осадка; 23. 25 – бункера для наполнителей; 24 – бункер для сухого препарата; 26 – установки дисмембраторов; 27, 28 – весы; 29 – смесители непрерывного действия; 30 – бункера для стандартизированного препарата; 31 – установки для фасования и упаковывания препаратов; 32 – установка для экстракции ферментов; 33 – сушилка для биошрота; 34 – резервуар для воды; 35 – стерилизационная установка для сточных вод; 36 – охлаждающий теплообменник; 37 – фасование и упаковывание жидкого препарата Г2х или П2х.

Для получения более очищенного препарата концентрат из сборника подается на осаждение органическим растворителем. Предварительно концентрат охлаждают в теплообменнике до температуры 2 – 3 °С и подают через дозатор в осадитель. Одновременно в осадитель дозируется охлажденный растворитель. Образовавшийся осадок отделяют на сепараторе 16. Надосадочную жидкость направляют на регенерацию, а осадок – на промывку спиртом и повторное сепарирование. Промытый осадок высушивают в вакууме, измельчают, взвешивают, смешивают с наполнителем и направляют на фасование и упаковывание.

При получении ферментных препаратов из культур микроорганизмов, выращенных поверхностным способом, процесс очистки начинается с экстракции ферментов водой. Нерастворимый осадок высушивают и в виде сухого биошрота утилизируют на корм скоту.

Экстракт с содержанием сухого вещества 7 – 14 % при получении из него сухих препаратов не нуждается в дополнительном концентрировании и поэтому может быть сразу направлен на распылительную сушку с целью получения технического препарата, или же экстракт направляется в охладитель, а затем на осаждение органическими растворителями или солевыми растворами. Из экстракта можно получать стабильный жидкий концентрат с содержанием сухого вещества 50%, для чего экстракт направляют в сборник, затем в подогреватель и на вакуум-выпарную установку. Готовый жидкий концентрат фасуют в специальные емкости и направляют на склад готовой продукции. Из глубинной культуры можно также получать жидкие концентраты, например, методом ультрафильтрации.

Существуют многочисленные схемы получения ферментных препаратов различной степени очистки, вплоть до кристаллических и гомогенных препаратов. Такие схемы, созданные в различных странах мира, в большинстве своём очень сложны и сочетают в себе самые различные комбинации технологических приёмов. Поэтому давать какие-то общие рекомендации крайне трудно, и в каждом конкретном случае необходимо проводить кропотливые исследования на всех стадиях выделения фермента из данной культуры продуцента. Только в результате такой работы можно придти к практическим рекомендациям, которые будут справедливы только для данного фермента, данной культуры микроорганизма и для данной среды.

 

1.3.3 Получение неочищенных ферментных препаратов

Неочищенные ферментные препараты представляют собой культуру микроорганизма вместе с остатками питательной среды, высушенную при мягком режиме до влажности не более 8 – 12 %.

Неочищенный ферментный препарат может быть получен на основе поверхностной или глубинной культуры. Глубинная культура может быть перед сушкой очищена от нерастворимой части (твердая взвесь среды и биомассы продуцента) или высушена вместе с ней.

Большинство продуцентов накапливает основную часть синтезируемых ими ферментов в питательной среде. При получении очищенных ферментных препаратов нерастворимую часть среды вместе с биомассой продуцента отделяют на фильтрах, центрифугах или сепараторах.

На этой стадии стерильность процесса чаще всего нарушается.

Эффективность отделения биомассы во многом зависит не только от типов используемых аппаратов, но и от состава среды, размеров отделяемых частиц, количества нерастворимой фракции, физико-химических характеристик фильтрующих материалов, температурных режимов и т. д. Для улучшения процесса фильтрования проводят предварительную химическую обработку культуральной жидкости. Для этого культуральную жидкость подщелачивают до рН 8 – 8,5 и вводят 0,1 %-ный раствор хлористого кальция, в результате образуется гель фосфата кальция, который способствует наиболее полному отделению осадка при наименьших потерях. Но предварительная химическая обработка не всегда дает хорошие результаты, поэтому для повышения эффективности процесса часто используют различные кизельгуры, например, диатомит и радиолит (Япония), микрозил (Франция), диатомит (Бельгия), кларгель (Великобритания) и т. д. Использование этих наполнителей может резко повысить скорость фильтрования, но вместе с этим увеличиваются потери активности на этой технологической стадии.

Полученную биомассу продуцента вместе с нерастворимыми частицами среды (биошрот) при необходимости стерилизуют, высушивают и используют на корм животным. Фильтрат культуральной жидкости нестабилен, он не может храниться и должен немедленно направляться на дальнейшую обработку для получения очищенных ферментных препаратов.

 

1.3.4 Экстрагирование ферментов

Все ферменты являются водорастворимыми белками, поэтому наилучшим экстрагентом для них является вода. Для извлечения ферментов из дрожжей или бактерий необходимо подвергнуть механическому или автолитическому разрушению их клеточные стенки, обладающие высоким диффузионным сопротивлением. Оболочки мицелиальных нитей имеют меньшее диффузионное сопротивление, чем оболочки бактериальных и дрожжевых клеток, поэтому дезинтеграции культуры грибов не требуется.

Извлечение ферментов проводят как из влажных, так и из сухих поверхностных культур грибов. Сухая культура может храниться длительное время без потери активности ферментов, и из нее получают более концентрированные экстракты. Технологически это выгоднее, но при подсушивании культуры имеют место потери активности, и потому экстрагирование целесообразно вести из влажной культуры. При экстрагировании различные водорастворимые вещества извлекаются из культуры с неодинаковой скоростью, происходит их частичное фракционирование, удельная активность ферментов в экстракте повышается в 3,5 – 4 раза по сравнению с исходной культурой в результате отделения большой части веществ (до 75 %) с нерастворимым остатком – биошротом.

На полноту экстрагирования ферментов из культур оказывают влияние многие факторы: температура, рН, длительность процесса, конструктивные особенности экстракционных аппаратов, природа извлекаемого фермента, количество отобранного экстракта с единицы массы загруженной в аппарат культуры и т. д.

Одновременно с ферментами экстрагируются многие другие соединения, и часто скорость извлечения балластных веществ больше скорости экстрагирования из культуры целевого фермента. Поэтому рациональнее пойти на некоторые потери фермента и закончить экстрагирование на оптимальном значении отношения активности фермента в экстракте к сумме извлекаемых веществ. Этот вопрос решается экспериментально для каждого вида продуцента.

Влиять на процесс экстрагирования с помощью такого фактора, как температура, практически невозможно, так как ферменты очень термолабильны и инактивируются даже при 35 – 40 °С (рис. 4). Кроме того, повышение температуры до 35 – 40 °С влечет за собой увеличение содержания сухого вещества в экстракте и уменьшение удельной ферментативной активности на 1 г сухого вещества, повышение опасности инфицирования экстрактов. Поэтому при проведении экстракции в заводских условиях стремятся подавить развитие микрофлоры путем максимального снижения температуры воды до 22 – 25 °С и применения антисептиков (формалин, бензол, толуол, хлороформ и др.). В большинстве случаев ферменты наиболее полно извлекаются при рН 5 – 7.

Для получения концентрированных экстрактов при небольших потерях ферментов с биошротом необходимо применять специальные экстракционные установки. Ранее широко использовались диффузионные батареи (рис. 5). В них можно получить экстракт с содержанием сухого вещества от 7 до 14 % в зависимости от вида культуры, среды и величины отбора экстракта. Но эти установки для экстрагирования ферментов из поверхностной культуры имели сравнительно небольшую производительность, требовали больших затрат ручного труда, и в них наблюдались сравнительно большие потери активности.

Более перспективным в этом отношении является экстрактор непрерывного действия фирмы «Ниро Атомайзер» (Япония), работающий под избыточным давлением (рис. 6). Экстрактор представляет собой наклонную цилиндрическую емкость, снабженную двумя шнеками, теплообменными рубашками и насосами. Культура через дозирующее устройство 5 подается внутрь цилиндра, а с противоположной стороны вводится растворитель (вода). Экстракт выходит из установки через самоочищающийся фильтр, а биошрот удаляется с противоположного конца. В случае необходимости, если ферменты экстрагируются не полностью, можно осуществлять двухступенчатое экстрагирование, увеличивая длительность процесса. Вторичный экстракт может быть использован в качестве растворителя для первой ступени экстрагирования. Общая продолжительность экстрагирования регулируется частотой вращения шнеков. Вторичный биошрот используется как компонент среды или после обеспложивания в кормопроизводстве.

 

1.3.5 Концентрирование ферментных растворов методом вакуум-выпаривания

Экстракты из поверхностных культур микроорганизмов и фильтраты глубинной культуры являются нестабильными при хранении. Для получения готовых форм технических препаратов (П2х и Г2х) их необходимо сконцентрировать. Чаще всего для этих целей в технологии ферментных препаратов используются методы вакуум-выпаривания. Вакуум-выпаривание также применяется как один из этапов получения сухих технических или очищенных ферментных препаратов. Ферменты очень чувствительны к температуре выпаривания, поэтому основным условием концентрирования ферментных растворов является кратковременное ведение процесса при низких температурах кипения, чтобы выпариваемая жидкость не перегрелась, а ферменты не инактивировались. Следует учитывать, что чем чище раствор, чем меньше он содержит сопутствующих веществ, тем ферменты более чувствительны к воздействию высоких температур (рис. 11). При концентрировании экстрактов из поверхностных культур инактивация ферментов значительно меньше, так как в экстракте содержится очень большое количество защитных соединений, которые препятствуют инактивации ферментов. При концентрировании фильтратов культуральной жидкости наблюдаются несколько большие потери, поэтому ферменты культуральной жидкости стабилизируют различными соединениями (табл. 2). В процессе концентрирования ферментных растворов происходят изменение растворимости многих соединений и выпадение их осадков, и суммарное содержание сухого вещества в концентрате снижается на 11 – 20 %, изменяется рН концентрата (рис. 7). В осадок выпадают минеральные соли, некоторые органические вещества и продукты их распада, наблюдается потеря азота в результате уноса аммиака.

При концентрировании культуральной жидкости В. mesentericus значительно изменяется минеральный состав концентрата. Наиболее резко снижается содержание кальция, меди и магния, заметно уменьшается содержание цинка и марганца. Такое изменение минерального состава культуральной жидкости сказывается на стабильности ферментов в процессе концентрирования (рис. 13, б). При сгущении культуральной жидкости до содержания сухого вещества 10 % количество кальция снижается всего на 5 %, а меди – на 75 %. Известно, например, что медь оказывает на ферменты ингибирующее действие, а кальций – стабилизирующее. Поэтому на первых стадиях концентрирования наблюдается повышение активности ферментов, особенно протеиназ. При более глубоком концентрировании вместе с резким снижением содержания кальция снижается активность ферментов.

Большинство ферментов очень чувствительно к термической обработке и нуждается в мягких режимах концентрирования. На рисунке были приведены данные по инактивации нейтральной протеиназы В. subtilis 103 в зависимости от температуры кипения раствора от 20 до 50 °С и температуры греющего пара от 90 до 120 °С. Из рисунка видно, что очень большое влияние оказывает температура теплоносителя. При низких температурах кипения (25 – 30 °С) происходит заметная инактивация ферментов (до 12 %), если температура греющего пара равна 120 °С. При температуре теплоносителя 90 – 100 °С и температуре кипения 35 – 40 °С потери активности не превышают 10 %. В зависимости от вида продуцента культуральная жидкость имеет различный химический состав и содержит различный комплекс ферментов, поэтому тепловые режимы вакуум-выпаривания уточняются экспериментальным путем.

Суммарные потери активности при вакуум-выпаривании в значительной степени зависят не только от режима концентрирования, но и от конструкции аппарата. Аппараты для стадии вакуум-выпаривания в последние годы значительно усовершенствованы, в десятки раз сокращена длительность процесса, что привело к значительному уменьшению потерь активности ферментов, а также позволило несколько ужесточить температурные режимы концентрирования ферментных растворов. Помимо трубчатых вакуум-выпарных установок с различным расположением трубой (горизонтальным, вертикальным и наклонным), со встроенной и выносной поверхностью нагрева, с использованием принудительной циркуляции созданы новые конструкции пленочных выпарных аппаратов, ультрацентробежных вакуум-выпарных установок и пластинчатых испарителей. Особый интерес представляют ротационные пленочные выпарные аппараты, где упариваемая жидкость в виде пленки движется по внутренней стенке аппарата. Лопатки, смонтированные на вращающемся роторе, непрерывно направляют движение ее сверху вниз. Время прохождения жидкости через аппарат составляет несколько секунд. В настоящее время фирма «Альфа-Лаваль» изготовляет вакуум-выпарные центробежные аппараты типа «Центритерм». Они очень компактны, время контакта ферментного раствора с обогревающей поверхностью предельно сокращено (не более 1 с), потери не превышают 10 %, производительность этих установок от 800 до 4800 л/ч.

Создана центробежная вакуум-выпарная установка пленочного типа производительностью 800 л/ч по испаренной влаге. Время контакта культуральной жидкости с теплоносителем не более 1 с, температура греющего пара 60 – 80 °С. Для увеличения производительности можно монтировать установку из трех модулей, каждый из которых работает либо автономно, либо последовательно, либо первые два модуля работают параллельно и соединены с третьим модулем последовательно. Представляет интерес для ферментной промышленности центробежная пленочного типа вакуум-выпарная установка «Единство» (Югославия) производительностью до 200 л/ч и с температурой упаривания 30 – 40 °С. Хорошие технологические показатели имеют роторные выпарные аппараты фирмы «Люва» (Швейцария), имеющие производительность по испаренной влаге от 50 до 200 л/(м2·ч). Французская фирма APV изготовляет пластинчатые вакуум-выпарные установки производительностью до 20 000 л/ч.

Несмотря на наличие высокопроизводительных вакуум-выпарных аппаратов полностью устранить недостатки метода вакуум-выпаривания не удается (потери активности, выпадение осадков и т. д.), и этот метод все больше заменяется методом ультрафильтрации.

 

1.3.6 Другие промышленные методы очистки, концентрирования и стабилизации ферментных препаратов

В ферментной промышленности для очистки белков от различных низкомолекулярных примесей (ионов солей, сахаров и т.д.) применяют мембранные методы очистки: диализ и электродиализ и баромембранные методы: обратный осмос, ультрафильтрацию, микрофильтрацию и тонкую фильтрацию.

Также используют осаждение белков органическими растворителями, высаливанием, органическими полимерами и путём избирательной денатурации; разделение белов хроматографическими методами.

Сушка ферментных препаратов имеет целью получить стабильный при хранении ферментный препарат из культуральной жидкости, её концентратов, из пастообразной массы, образующейся при высаливании, осаждении фермента спиртом или другими осадителями и т. д. Для обезвоживания ферментных растворов и осадков применяют сушку в вакуум-сушильных шкафах, распылительных и сублимационных установках. При этом возникает ряд проблем, связанных с большой термолабильностью ферментов.

Получаемые ферменты порой с целью стабилизации иммобилизуют, микрокапсулируют, гранулируют.

 

1.4 Микробиологический и биохимический контроль производства

Независимо от способа культивирования с момента засева продуцентом стерильной питательной среды ведется контроль за ростом культуры и образованием ферментов. Для каждого вида продуцента и способа культивироваиня устанавливается своя периодичность отбора средних проб растущей культуры. Отобранные пробы подвергаются микроскопированию и визуальному просмотру. С целью выявления возможных заражений производится периодический высев проб на агаризорованные среды с введением факторов, подавляющих рост продуцента. Постоянно ведется определение накопления в культуре ферментативной активности. При глубинном культивировании ведут контроль за потреблением основных лимитирующих компонентов среды (углеводы, N, Р), измеряют рН культуры.

Все показатели роста культуры, изменения состава среды и накопления ферментов и т. д. заносятся в лабораторный журнал.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6