Курсовая работа: Методика определения и показатели устойчивости бактерий к дезинфеткантам

Курсовая работа: Методика определения и показатели устойчивости бактерий к дезинфеткантам

  курсовая работа

по микробиологии

на тему "методика определения и показатели устойчивости бактерий к дезинфеткантам"    

пенза, 2010

содержание

Введение

1. Общие положения об устойчивости бактерий к дезинфектантам на примере четвертичных аммонийных соединений

2. Методики определения и показатели устойчивости бактерий к дезинфектантам

2.1 Методика Е.И. Гудковой и А.П. Красильникова

2.1.1 Описание предлагаемой методики

2.1.2 Сравнительная оценка предлагаемой и референтной методик

2.1.3 Показатели чувствительности (устойчивости) бактерий к дезинфектантам

2.2 Методика, основанная на применении цветной питательной среды, больших доз бактерий и пластмассовых пластин с луночками

Заключение

Библиография

Введение

Актуальность темы курсовой работы не вызывает сомнений.

Ученым было давно известно, что бактерии могут приобретать сопротивляемость к дезинфектантам, но новые опыты показывают, что в результате воздействия дезинфицирующих препаратов бактерии становятся устойчивыми к некоторым видам лекарств. Более того, бактерии становятся невосприимчивыми к некоторым антибиотикам, с которыми они прежде не сталкивались. Устойчивость бактерий является антонимом термина чувствительность. В соответствии с этим устойчивость бактерий к дезинфектантам - свойство бактерий, проявляющееся в их способности к росту и размножению в присутствии дезинфицирующего средства в определенных концентрациях [17; С. 78].

Дезинфицирующие препараты, как явствует из последних исследований, могут фактически "обучать" бактерии, придавая им устойчивость к антибиотикам.

Например, ученые выяснили, что внесение растущих доз дезинфицирующих препаратов в лабораторные культуры так называемой синегнойной палочки (pseudomonas aeruginosa) приводит к тому, что бактерии вырабатывают резистентность не только к дезинфектанту, но также к ципрофлоксацину - распространенному антибиотику - даже без контакта с этим препаратом. По заключению ученых, бактерии приобретают способность вырабатывать антимикробные агенты, которые сопротивляются как дезинфектантам, так и антибиотикам.

В бактериях также происходят мутации ДНК, в результате которых они обретают сопротивляемость конкретно к антибиотикам типа ципрофлоксацина. Синегнойная палочка - вид бактерии, которая с наибольшей вероятностью атакует человека, который уже серьезно болен.

Она вызывает целых ряд инфекционных заболеваний, особенно у людей, чья иммунная система ослаблена - больных СПИДом, раком, диабетом, кистозным фиброзом или пострадавших от сильных ожогов. Для борьбы с распространением этих бактерий применяются поверхностные дезинфектанты. Однако если бактериям удается пережить обработку и проникнуть в организм, для лечения применяются антибиотики [9].

Ирландские ученые в результате последних исследований представляют доказательства того, насколько серьезную опасность для больного могут представлять бактерии, которым удается пережить оба этапа воздействия.

При обычно применяемых высоких уровнях концентрации такая проблема возникать не должна, но "в принципе это означает, что следы неправильно приготовленного раствора дезинфектанта в больничных помещениях могут способствовать возникновению невосприимчивых к антибиотикам бактерий".

Это не первое исследование, результаты которого вызывают озабоченность тем, что дезинфектанты приводят к повышению устойчивости бактерий к антибиотикам. В 2009 году уже был опубликован доклад Евросоюза, в котором подчеркивается важность "надлежащего и разумного" применения дезинфектантов с тем, чтобы минимизировать риск возникновения в бактериях сопротивляемости к обоим видам воздействия [18].

Целью исследования является изучение методик определения и показателей устойчивости бактерий к дезинфектантам.

Для достижения указанной цели поставлены следующие задачи:

- рассмотреть общие положения об устойчивости бактерий к дезинфектантам на примере четвертичных аммонийных соединений;

- описать методики определения и показатели устойчивости бактерий к дезинфектантам;

В качестве предмета исследования выступили методика определения и показатели устойчивости бактерий к дезинфектантам.

Методологической основой работы служит диалектический метод познания и анализ рассматриваемых явлений.

Характер рассматриваемых в курсовой работе вопросов обусловил использование комплекса основных методов:

–  материалистические;

–  исторические;

–  метод сравнительного анализа;

–  формально-юридический метод;

–  эмпирические;

–  источниковедческие.

Выбор структуры курсовой работы обусловлен последовательностью решения поставленных задач и логикой изучения темы.

–  В первой главе рассматриваются общие положения об устойчивости бактерий к дезинфектантам на примере четвертичных аммонийных соединений.

–  Во второй главе описываются методики определения и показатели устойчивости бактерий к дезинфектантам.

При написании курсовой работы были изучены учебные материалы, монографии, публикации на страницах периодической печати.

 

1. Общие положения об устойчивости бактерий к дезинфектантам на примере четвертичных аммонийных соединений

Известно бактерии имеют характерный спектр и уровень естественной устойчивости к конкретной группе химических средств или конкретному дезинфицирующему средству. Наряду с естественной (природной) устойчивостью бактерий, может формироваться приобретенная устойчивость. Приобретенная устойчивость является результатом изменчивости, в результате которой бактерия приобретает новые или утрачивает исходные признаки. У большинства бактерий изменчивость выражена значительнее, чем у высших организмов, что связано с коротким периодом генерации и другими факторами. И если генотипическая изменчивость передается по наследству, то фенотипическая - не передается [8; С. 141].

Установлена возможность формирования устойчивости бактерий к некоторым четвертичным аммониевым соединениям.

Четвертичные аммонийные соединения (ЧАС) - это соли с четвертичным атомом азота в качестве характерной химической группы. Одна из четырех углеродных связей, как правило, имеет более 10 углеродных атомов.

В настоящее время ЧАСы имеют широкую область применения, терапевтическая антисептика местных гнойно-воспалительных процессов, профилактическая антисептика неповрежденной кожи перед операциями, антисептика слизистых оболочек, консервирование глазных капель, инъекционных растворов, зубных паст, косметических средств; дезинфекция и очистка поверхностей, дезодорирование.

Современные ЧАСы характеризуются умеренно широким спектром антимикробной активности, не имеют запаха, бесцветны, обладают слабой коррозийной активностью, эффективностью е широком диапазоне рН, устойчивостью к высоким температурам, стабильностью концентратов и рабочих растворов, относительной толерантностью к присутствию органических веществ, остаточным бактериостатическим действием на обрабатываемых поверхностях, низкой токсичностью, прекрасными моющими свойствами [11].

Устойчивость бактерий к дезинфицирующим средствам подразделяется на естественную (видовую) и приобретенную. Естественная устойчивость к ЧАС характерна для грамотрицательных бактерий, бактериальных спор. Механизм такой устойчивости: непроницаемость клеточной стенки для молекул ЧАС. Среди фамотрицательных бактерий наибольшей резистентностью обладает Р.aerruginosa. Это обусловлено высоким содержанием ионов магния в клеточной стенке псевдомонад, что способствует созданию сильных связей между молекулами липополисахаридов, кроме того, малые размеры пор не позволяют осуществлять диффузию молекул ЧАС через клеточную стевку.

Механизм высокой резистентности микобактерий связан с повышенным содержанием арабиногалактана, липидов и восков, придающим выраженную гидрофобность клеточной стенке. Вследствие этого гидрофильные молекулы дезинфектантов не способны проникать через клеточную стенку в количествах, необходимых для достижения микобактерицидного эффекта. Показано, однако, что уровень активности ЧАС в отношении микобактерий может быть значительно увеличен с помощью изменений в составе формул и создания новых препаратов.

Наличие естественной устойчивости к соединениям из групп ЧАС отмечено также у некоторых мукоидных штаммов стафилококков. Слизистый слой, окружающий бактериальные клетки, является барьером для проникновения молекул ЧАС, кроме того, наблюдаются взаимодействие компонентов слизи с дезинфектантом и поглощение (нейтрализация) активно действующих веществ.

Приобретенная устойчивость к ЧАС обусловлена генотипическими (наличие генов устойчивости, локализованных в плазмидах, хромосоме или транспозонах) или фенотипическими механизмами. Плазмидная устойчивость установлена для Е.соli, S.аureus, S.epidermidis. Показано, что около 40% изолятов коагулазоотрицательных стафилококков имеют гены устойчивости к ЧАС, локализованные в Р-плазмиде, детерминирующей резистентность к лактамным антибиотикам и солям тяжелых металлов.

Биохимический механизм такой устойчивости - выведение молекул дезинфектанта из клетки. Мутационный механизм генотипической устойчивости к ЧАС выявлен у Р.аеroginosa. Такой тип устойчивости обусловлен изменением профилей жирных кислот и белков клеточной стенки, вследствие чего ограничивается проникновение через нее молекул дезинфектанта.

Фенотипичсская устойчивость к ЧАС, как и к другим биоцидам, связана со способностью бактерий образовывать биопленки, фиксированные на различных поверхностях, К бактериям, находящимся во внутренних слоях пленки, доступ молекул дезинфектантов ограничен. Кроме того, возможно химическое взаимодействие между дезинфектантом и биопленкой, в результате которого происходит нейтрализация активно действующих веществ.

Больничные изоляты бактерий являются менее чувствительными к дезинфектантам по сравнению с типовыми и внеболъничными штаммами. В появлении и распространения устойчивых к ЧАС вариантов бактерий, вероятно, имеют значение описанные выше генетические механизмы резистентности и селекции устойчивых культур при длительном применении в больницах дезсредств на основе одной группы активно действующих веществ [12; С. 10].

Исследования проведены с использованием тест-объектов, контаминированных микробными культурами.

К новым дезинфектантам на основе ЧАС, в состав которых входили также этанол, полигуанидин, амин, не было обнаружено устойчивых вариантов бактерий. Асфен 381 оказался неактивным в отношении 20,0% псевдомонад. К рекомендованным для практического применения концентрациям Микробак-форте были устойчивыми от 9,1 до 40,9% энтеробактерий, от 18,9 до 24,3% псевдомонад и от 0 до 20,0% стафилококков. Септабик в 0,12% концентрации проявил недостаточную активность в отношении большинства изученных изолятов энтеробактерий и псевдомонад. После действия 0,3% концентрации дезинфектанта при 60 - минутной экспозиции выживали 15,4% энтеробактерий и 7,2% стафилококков [6; С. 92].

Таким образом, ЧАС как монопрепараты вследствие относительно ограниченного спектра и невысокого уровня антимикробной активности могут применяться для дезинфекции и очистки некритических поверхностей в клиниках, на предприятиях пищевой промышленности и общественного питания. Введение в состав дезсредств на основе ЧАС активно действующих веществ, характеризующихся другими механизмами действия, приводит к расширению спектра и повышению уровня активности, способствует замедлению процессов формирования у микробов устойчивости [14; С. 341].

2. Методики определения и показатели устойчивости бактерий к дезинфектантам

 

2.1 Методика Е.И. Гудковой и А.П. Красильникова

В связи с появлением и распространением в природных средах устойчивых к дезинфектантам вариантов бактерий - возбудителей инфекционных болезней произошло снижение эффективности дезинфекционных мероприятий. Для предупреждения негативного действия этого явления на уровень заболеваемости инфекционными болезнями предложено установить контроль за циркуляцией устойчивых к дезинфектантам вариантов и изменять режим дезинфекции, исходя из полученных результатов. Ожидается, что введение этой меры должно повысить эффективность противомикробных мероприятий и затормозить селекцию и распространение устойчивых к дезинфектантам вариантов бактерий в окружающих человека экологических средах [15].

Реализация этого ценного предложения осложняется отсутствием адекватной методики. Применяемые в разных странах методики предназначены для определения активности дезинфектантов. Для испытания чувствительности (устойчивости) к дезинфектантам большого количества штаммов бактерий дикого типа они мало пригодны.

Для определения активности дезинфектантов в большинстве стран отдается предпочтение методикам с различными тест-носителями (батистовые тесты в методике, принятой в нашей стране, цилиндрики из нержавеющей стали в методике, принятой в США). Предлагаемая модификация относится к этой группе методов, но она специально предназначена для испытания чувствительности (устойчивости) бактерий к дезинфектантам.

 

2.1.1 Описание предлагаемой методики

Показания к применению методики: а) контроль за циркуляцией устойчивых к дезинфектантам штаммов бактерий в лечебно-профилактических учреждениях и эпидемических очагах; б) расследование причин неэффективности дезинфекционных мероприятий; в) установление причин микробной контаминации дезинфицирующих растворов; г) определение противомикробной активности дезинфектантов.

Материалы, необходимые для выполнения методики: испытуемые культуры, стандартные дезинфектанты; питательная среда АГВ для определения чувствительности бактерий к антибиотикам, специальные для отдельных групп бактерий среды, скошенный питательный агар; 0,9% раствор хлорида натрия, лошадиная сыворотка; нейтрализаторы дезинфектантов; штампы-репликаторы из нержавеющей стали с 50 штифтами, высота которых должна соответствовать 10 мм, диаметр 3 мм, площадь концевой площадки 7,1 см2, посевной объем 0,001 мл; опорные кольца для высушивания контаминированных репликаторов; бумажный эталон с номерами штифтов репликатора; термостат, пипетки, бактериологические чашки, стандарт мутности и др. [7; С. 48-50].

Для испытания на устойчивость используют чистые культуры бактерий, выделенные с помощью стандартных методик. Испытание проводят не позже 1-2 дней после выделения. Перед испытанием культуры засевают на скошенный питательный агар, выращивают в термостате при 37° С в течение 16-20 ч, смывают 0,9% раствором хлорида натри с 20% лошадиной сыворотки, стандартизируют плотность" в 2-109 бактерий/мл. Культуры испытывают раздельно; при массовых исследованиях допустимо объединение нескольких культур из одного объекта.

Поскольку подавляющее большинство дезинфектантов применяют в виде водных растворов, функциональные свойства которых определяются концентрацией присутствующего в них активно действующего начала, объективной характеристикой чувствительности к препарату служит концентрация дезинфектанта, вызывающая гибель 100% внесенных бактерий в фиксированное время. Такой подход в отличие от использования различных временных интервалов при фиксированной концентрации, кроме того, обеспечивая большую возможность количественной оценки и более привычен для практических бактериологов.

Дезинфектанты разводят стерильной теплой водой в асептических условиях в концентрациях, зависящих от используемых показателей.

По описанной в п. 1.3 методике готовят взвеси испытуемых культур.

Взвесями бактерий контаминируют штифты штампа - репликатора (одновременно в одном репликаторе может быть испытано 50 культур, а в случае смешанных культур - в несколько сколько раз больше). Для этого в лунки основания репликатора пастеровской пипеткой вносят взвеси испытуемых культур до образования вогнутого мениска (2-3 каш штифты крышки репликатора опускают в лунки, содержал взвеси бактерий, глубина погружения штифтов должна составлять 2-3 мм; спустя 5 мин крышку с штифтами снимают с лунок и помещают на опорное кольцо для высушивания бактериальной взвеси. Высушивают в асептических условиях на воздухе при комнатной температуре в затемненном месте.

Дезинфекцию штифтов проводят в лунках репликатора, в которые предварительно пипеткой вносят заданный раствор дезинфектанта. После этого в лунки с дезинфектантом осторожно опускают контаминированные бактериями штифты. Глубина погружения должна соответствовать примерно 4-5 мм, что контролируется ограничителем штифта.

После 10-минутной экспозиции в дезинфектанте штифты переносят в лунки штампа-репликатора, заполненные нейтрализатором, и выдерживают в нем 10 мин. Глубина погружения штифтов должна быть больше, чем уровень погружения штифтов в дезинфектант, что также обеспечивается ограничителем. Для нейтрализации хлорамина, диконита, перекиси водорода, препаратов йода используют 1% раствор тиосульфита натрия (гипосульфита хлоргексидина-0,6% раствор сульфонола, формалина- 1% раствор сульфита натрия, фенола и его препаратов-3% твин-80 (полисорбат) с 0,3% лецитина (или 1,5% эмулз куриного желтка).

В контроле роста бактериальных культур контаминированные описанным выше способом штифты погружают на 20 минут в лунки со стерильной водой, в контроле нейтрализатора контаминированные штифты екают на 10 мин в раствор нейтрализатора.

После истечения экспозиции опытные и контрольные репликаторы извлекают из нейтрализатора (воды) и концевые площадки штифтов репликаторов на 5 с слегка прижимают к поверхности АГВ или другой питательной среды на бактериологических чашках. На дне чашки чертой обозначают верх, который при посеве-реплике должен совпадать с чертой на крышке репликатора. Посевы выдерживают в термостате 37° С в течение 48 ч, после чего на фоне бумажного эталона с номерами культур учитывают наличие или отсутствие роста бактерий в зонах посевов-отпечатков. Культуру считают устойчивой ко взятой в опыт концентрации дезинфектанта, если в зоне отпечатка опытной чашки вырастает хотя бы одна колония при условии сплошного роста на отпечатках контролей. Для повышения достоверности каждой испытуемой культурой (или ее субкультурами) следует контаминировать 3 штифта или проводить исследование 3-кратно.

 

2.1.2 Сравнительная оценка предлагаемой и референтной методик

Определены правильность и воспроизводимость предлагаемой и референтной методик (ГОСТ 16263-70). В качестве референтной взята широко применяемая в России методика батистовых тест-объектов ВНИИДиС.

Правильность оценивали путем сравнения результатов 10-ратного определения минимальной бактерицидной концентрации (МБК) хлорамина Б для 5 штаммов S. aureus с помощью предлагаемой и референтной методик. X ±SX МБК хлорамина в предлагаемой методике равнялась (в г/100 мл): у039±0,04, 0,085+0,016, 0,089 ±0,011, 0,107 ±0,033, 1,074 + 0,011, в референтной соответственно: 0,038 ±0,05, 1,098±0,022, 0,116±0,024, 0,098 ±0,018, 0,106 + 0,021. Показатель р между сравниваемыми методиками во всех случаях был меньше 0,05, (-колебался от 0,16 до 1,33. Следовательно, различия между результатами предлагаемой и референтной методик недостоверны, что является показателем правильности первой.

Воспроизводимость (в серии и во времени) оценивали путем сравнения результатов 10-кратного испытания чувствительности 25 штаммов S. aureus к хлорамину с установлением ДБК в ряде. Мерилом разброса результатов вокруг средней арифметической служили среднеквадратическое отклонение (о) и коэффициент вариации (К). Как видно из таблицы, разброс результатов в обоих методиках относительно высок, что, вероятно, является как результатом гетерогенности популяции стафилококка по признаку чувствительности к дезинфектанту, так и следствием совершенства методик. Воспроизводимость предлагаемой методики по сравнению с референтной оказалась более высокой.

Для сравнения экономичности проведен хронометраж, который показал, что предлагаемая методика в течение 7 ч позволяет определить МБК 3 дезинфектантов у 50 культур затратой 510 мл питательной среды. Для того чтобы такой объем работы выполнить методикой батистовых тест-объектов требуется 102 ч и 15 500 мл питательной среды. Следовательно, предлагаемая методика дает экономию времени в 14,6 раза, питательных сред - 30,4 раза. Преимущество предлагаемой методики перед референтной также состоит в большей дискретности показателей и привычности постановки и оценки, поскольку близкий подход используется при определении чувствительности к антибиотикам и антисептикам.

 

2.1.3 Показатели чувствительности (устойчивости) бактерий к дезинфектантам

Практическое здравоохранение не имеет не только унифицированных методов испытания чувствительности культур такого типа бактерий к дезинфектантам, но и общепринятых показателей оценки этого явления. В том классе методик, которому относится предлагаемая нами, оценка активности препарата или чувствительности бактерий проводится по МБК при стабильной экспозиции или по минимальной экспозиции при стабильной концентрации препарата, причем как стандартная концентрация, так и стандартная экспозиция не унифицированы.

Страницы: 1, 2