Учебное пособие: Определение уровня естественной резистентности и оценке иммунного статуса рыб

• Определение Т-, В-, Д-И 0-лимфоцитов (по Мэндес, 1973).
Принцип метода. При смешивании лимфоидных клеток рыб с эритроцитами
барана (ЭБ), частичками зимозана, сенсибилизированными макроглобулиновыми
антителами с комплементом, происходит их избирательная адсорбция
лимфоидными клетками: на Т-лимфоцитах адсорбируются эритроциты барана, на
В-лимфоцитах - частицы зимозана, на Д-лимфоцитах - частицы зимозана и
эритроциты барана; 0-лимфоциты остаются свободными от эритроцитов и
частичек зимозана. Данный метод применяется для идентификации
популяционной структуры лимфоцитов.

Компоненты, материалы и оборудование. Лф - суспензия лим-({юцитов рыб,
концентрацией 2 млн. клеток/мл, в среде 199 (или Хснкса). Способ получения Лф
(см. выше). ЭБ - 0,5%-ная взвесь эритроцитов барана - индикаторы для Т-
лимфоцитов; частицы зимозана конъюгирован-ньге с комплементом (индикаторы
для В-лимфоцитов). Разбавители: физ-раствор, среда 199. Материалы и
оборудование: гепарин, хлористый аммоний, 0,2%-ный раствор трипановой сини,
глутаральдсгид,разделяющий раствор с плотностью 1,077 г/мл,
силиконизированныс цснтрифужные и другие пробирки, пипетки, счетные камеры
Горяева или Бюркера, холодильник, фазовоконтрастный микроскоп.

Техника постановки реакции. В силиконизированную пробирку приливают
по 0,1 мл взвеси лимфоцитов, 0,5%-ной взвеси эритроцитов барана и частички
зимозана с комплементом. Смесь клеток инкубируют 5 мин при 26°С,
центрифугируют 5 мин при 800-1000 об/мин и вновь инкубируют при 12° С - 60
мин. Осадок осторожно ресуспендируют, наносят каплю взвеси клеток на
предметное стекло, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Из капли
взвеси можно готовить мазки на предметных стеклах и покрасить их но
Романовскому-Гимза.

Учет и оценка результатов реакции осуществляются одновременно и
параллельно в световом и фазово-контрастном микроскопах. Просматривают 200
лимфоцитов и определяют процент РОК. Т-лимфоцит образует розетку из 3 и
более ЭБ, В-лимфоцит - из 3 и более частиц зимозана;
Д-лимфоцит образует смешанную розетку - 2 ЭБ + 2 и более частиц зимозана; 0-
лимфоцит розеток не образует.

3.2. Гуморальные факторы

3.2.1. Имуноглобулины. Они являются биохимической основой
специфического гуморального иммунитета, выполняют функцию специфических
антител к конкретным антигенам, синтезируются плазматическими клетками (В-
лимфоцитами) и секретируются в кровь или тканевые жидкости. Основная их
часть относится к гамма - глобулиновой фракции сыворотки крови.

Методы определения содержания в организме рыб иммуноглобули-нов
основаны на оценке содержания гамма-глобулинов в сыворотке крови или других
биологических жидкостях. Простыми и доступными приемами исследования
гамма-глобулинов в сыворотке крови и других жидкостях являются методы
электрофореза, хроматографии на анио-нообменниках, осаждения насыщенными
растворами фосфатов или сульфатов. Существуют также иммунологические
методы определения содержания гамма-глобулинов у рыб с помощью
антисывороток.

 Определение иммуноглобулинов в сыворотке крови рыб по гамма-
глобулину методом осаждения.

Принцип метода. При взаимодействия с насыщенными растворами
фосфатов, определенной концентрации гамма - глобулины осаждаются. изменяя
тем самым оптическую плотность исследуемого образца. Определение
производится параллельно с другими фракциями сыворотки крови (альбуминами,
альфа и бета-глобулинами), по изменению оптической плотности (ОП) на ФЭКе.

Оборудование и реактивы. ФЭК, химические пробирки, пипетки на !. 2, 5, 10
мл, бюретка на 100 мл, мерные колбы на 100 и 500 мл, холодильник, сыворотка
крови, фосфатные растворы (основной и рабочий), штативы для пробирок.

Материал для исследования, ход определения и учет результатов. Вначале
готовят основной фосфатный раствор: 335 г гидроокиси натрия растворяют в 400
мл дистиллированной воды, добавляют 226,8 г фосфорнокислого калия
однозамещснното. После растворения охлаждают до комнатной температуры и
добавляют дистиллированную воду до объема 500 мл, затем готовят рабочие
фосфатные растворы для осаждения каждой (фракции белков. Берут 4 мерных
колбы на 100 мл, которые нумеруют соответственно n 1, 2, 3 и 4. В каждую колбу
вносят строго определенное количество основного фос4)атного раствора: 92,4 мл -
n 1, 74,9 мл - n 2. 58,8 мл - n 3, 48,7 мл - n 4 и до метки 100 мл доливают
дистиллированную воду. После этого рабочие растворы в колбах тщательно разме-
шивают путем встряхивания (при хранении добавляют i каплю хлороформа на 100
мл раствора). После приготовления (фосфатных растворов приступают к
определению белковых фракций в исследуемых образцах. На каждую пробу
сыворотки крови берут 6 пробирок и нумеруют: 0. 1, 2, 3, 4, 5. В пробирку под
цифрой 0 вносятся 10 мл дистиллированной воды, в пробирки под номерами 1, 2, 3
и 4 - по 5 мл соответствующих этим цифрам рабочих фосфатных растворов. В
пробирку n5 вносят 0.5 мл исследуемой сыворотки крови, 0.75 мл
дистиллированной воды и 3.75 мл основного фосфатного раствора, пробирку
закрывают пробкой и перемешивают путем перевертывания ее 5-6 раз, после чего
из этой пробирки переносят по 0.5 мл смеси в пробирки n i, 2, 3, 4 и 1 мл в
пробирку под номером 0 (контроль). Содержимое пробирок тщательно и осторожно перемешивают, избегая образования пены и пузырьков воздуха и выдерживают 15 мин при комнатной температуре. По истечении указанного срока осуществляют измерение ОГГ растворов в пробирках n 1, 2, 3, 4 против контроля (n 0) на ФЭКс при красном
светофильтре в кювете с длинной оптического пути 1 см. Определение оптической плотности проводится сначала в пробирке n4, затем в пробирках n 3, 2 и 1.
Расчет результатов  производится по схеме: ОП пробирки n1 - ОП пробирки n2 = ОП альбуминов; ОП пробирки n2 - ОП пробирки n3 = ОП альфа-глобулинов;
ОП пробирки n3 - ОП пробирки n4 = ОП бета-глобулинов;
ОП пробирки n4 = ОПгамма-глобулинов.

Принимая сумму ОП альбуминов и всех глобулиновых 4>ракций за 100%
(ОП пробирки n1), вычисляют долю содержания каждой фракции в процентах.
Процентное содержание гамма-глобулинов определяют по (формуле:
Относительное содержание гамма-глобулина, % = ОПкк х 1 ()(). где:
ЮП
ongg - гамма-глобулина (ОП - пробирки n 4), ?0n - сумма ОП всех белковых
фракций (ОП пробирки n 1), 100 - коэффициент перевода содержания гамма-
глобулина в %. Зная концентрацию общего белка в единице объема можно
произвести перерасчет в абсолютные величины. Ошибка метода составляет + 4%.

3.2.2. Антитела

Антитела представляют собой сывороточные белки, синтезируемые В-
лимфоцитами при попадании в организм антигена или чужеродных тел и
вступающие с ними во взаимодействие. Главными свойствами антител являются
специфичность и гетерогенность. Специфичность антител определяется
антигеном, вызывающим их синтез. Рыбы, как и высшие позвоночные,
синтезируют разнообразные по структуре и функции антитела: агглютинины,
преципитины, антитоксины, комплементсвязывающие и вируснейтрализующие
антитела, гемолизины, полные и неполные. Антитела по происхождению
подразделяются на естественные и индуцируемые (образующиеся после
парентерального и энтерального введения антигена). Они являются одной из
информационных структур иммунной системы, выполняющих функцию
иммунологической памяти об антигене. Благодаря высокой специфичности
антитела используются при определении природы антигенов, вызывающих их
синтез, напряженности активно приобретенного иммунитета, характера течения
процесса иммуногенеза и характера влияния благоприятных и неблагоприятных
факторов на иммунную систему рыб. Существуют многочисленные методы определения содержания антител в организме рыб: серологические, иммуноэлектрофоретические, радиоиммунные, иммуноферментные, иммунодиффузныс, лазерные.
Наиболее простыми и общепринятыми методами определения антител в
организме рыб являются: реакция агглютинации, реакция агглютинации дате кс-
антигена (или антител).

3.2.2.1.. Определение антител в реакции агглютинации,

Реакция агглютинации (РА) используется для идентификации возбудителя
болезни с помощью стандартной (референтной) агглютинирующей сыворотки.
Агглютинацией называется склеивание микробов агглютининами сыворотки в
присутствии электролитов, т.е. солевых растворов.

Принцип метода основан на установлении способности сыворотки крови
иммунных рыб склеивать микроорганизмы, вызвавшие этот иммунный ответ.

Оборудование и реактивы: пробирки стерильные; 0,65%-ный стерильный
раствор натрия хлорида; сыворотка крови обследуемых рыб; водяная баня,
отрегулированная на 60° С; одномиллиардная взвесь суточной культуры
инактивированных микроорганизмов возбудителей болезни рыб, приготовленная
на 0.65%- ном стерильном растворе натрия хлорида; термостат, отрегулированный
на 26° С; агглютиноскоп; пастеровские пипетки, пробирки, шприцы и
инъекционные иглы для взятия крови - стерильные.

Материал для исследования, ход определения ч учет. результатов.
В штатив размещают ряд из 8 или более пробирок. В первую вносят 0.2 мл
сыворотки, в остальные - такой же объем 0.65%-ного стерильного раствора натрия
хлорида. Во вторую пробирку к разбавителю добавляют 0-2 мл цельной сыворотки
и тщательно перемешивают содержимое пробирки пилотированием. Стандартный
объем (0.2 мл) смеси переносят в следующую (третью) пробирку, тщательно
смешивают с разбавителем и переносят в четвертую, и так далее до предпоследней
пробирки рядя, из которой стандартный объем смеси удаляют. В результате
получают серию разведении, в которой содержание исходной сыворотки (и
соответственно антител) убывает в геометрической прогрессии 1:2, 1:4, 1:8 и т.д.
до 1:64 и более. После внесения 0,2 мл жидкости в очередную пробирку пипетку заменяют на новую.

В пробирки с разведенной сывороткой (кроме первой - контроль сыворотки)
и в последнюю пробирку с физраствором (контроль антигена) вносят по 0.05 мл (1
капля) тест-антигена, тщательно перемешивают до получения равномерной взвеси
и помещают в термостат на 2-3 часа при 26°С. Контролем служат сыворотка и
антиген без сыворотки (первая и последняя пробирки ряда). Штатив с пробирками
вынимают из термостата и проводят предварительную оценку реакции, затем
оставляют при комнатной температуре на 20-24 часа. Окончательную оценку
реакции осуществляют с помощью агглютиноскопа. Учет реакции проводят по
четырехбалльной системе:

"++++" - полная агглютинация (осадок рыхлый в виде зонтика, жидкость над
осадком прозрачная, при встряхивании видны хлопья или зерна различной
величины);
"+++" - полная агглютинация (осадок такой же, надосадочная жидкость менее
прозрачна);
"++" - неполная агглютинация (осадок небольшой, надосадочная жидкость
непрозрачная);
"+" - следы агглютинации (осадок незначительный, надосадочная жидкость
непрозрачная);
"-" - отрицательная реакция (осадка нет, взвесь равномерно мутная).
В контроле антигена - осадка нет, взвесь равномерно мутная. Наивысшее
разведение исследуемой сыворотки, в которой происходит агглютинация
добавленных микробных клеток при оценке не менее, чем на два креста, считают
ее титром.

3.2.2.2. Реакция агглютинации латекс-антигена (или антител) - РА-ЛАг
(Зингер, Плотц, 1956).

Принцип метода. Реакция агглютинации мслкодисперсных частиц латекса,
нагруженных: антигеном (АГ), под воздействием специфических антител (at)
иммунной сыворотки или антителами, при взаимодействии с гомологичным АГ,
применяется для обнаружения содержания антител у иммунных рыб к разным АГ
и диагностики возбудителя болезни.

Компоненты и материалы. at - 5%-ный раствор растворимого антигена (в
качестве источника АГ могут служить гомогенаты аутоантигс-нов, возбудителей
болезни, вакцины, сыворотки крови и т.д.). Исследуемая сыворотка рыб. 10%-ная
суспензия частиц полистиролового латекса стандартной величины-от 0,77 до 0,81
мкм на 0.65% растворе nacl. Хранят при 2-4° С, но не дольше 4-х недель.
Разбавители: боратныи или глициновый буфер с рН 8,1-8,3. Боратный буфер: 50
мл 0,1 М раствора борной кислоты (6,184 г НзВОз растворяют в 1000 мл диет.
воды), 5,9 мл 0,1%-ного раствора naoh и 100 мл 0,85%-ного раствора хлорида
натрия. Глициновый буфер: к 1 л 0,1 М раствора глицина, доведенного до рН 8,2 с
помощью 1 н. раствора naoh, добавляют 10 г nacl. Материалы:
пипетки, пробирки, колбы и др.

Техника постановки реакции. Дм сенсибилизации частиц латекса к 0,1 мл
10%-ной суспензии мслкодиспсрсных частиц добавляют 0,5 мл 5%-ного раствора
АГ и 9,4 мл боратного буфера. Суспензию тщательно перемешивают и
выдерживают 2 ч при 26°С. Постановку реакции латскс-аплютинации начинают с
приготовления в дополнительном ряду пробирок разведении сыворотки
исследуемых рыб на боратном буфере в соотношениях от 1:10, 1:20 до 1:1280-
1:2560.

Капельная реакция латекс-агглютинации. В ряд микропробирок вносят по 2
капли соответствующих разведении исследуемой сыворотки и добавляют по 1
капле суспензии частиц латекса, сенсибилизированных соответствующим АГ. В
контроле смешивают аналогичные объемы частиц латекса с разведсниями
инактивированной нормальной сыворотки. Штатив с пробирками встряхивают и
выдерживают при 26° С 30 мин. Затем смеси центрифугируют при 1500 об/мин в
течение 3 мин, осторожно встряхивают н учитывают результат реакции.

Пробирочная реакция латекс-агглютинации. В опытный ряд пробирок
приливают по 1 мл соответствующих разведении исследуемой сыворотки и
добавляют по 1 мл латскс-АГ. Контрольные смеси: 1) борат-ньш буфср+суспснзия
латекс-АГ; 2) разведения нормальной сыворотки + суспензия латекс-АГ. Пробирки
встряхивают, помещают в водяную баню при 26°С на 2 ч, центрифугируют при
1500 об/мин в течение 10 мин, осторожно встряхивают и учитывают результат
реакции.

Учет и оценка результатов реакции производятся по образованию зерен
латсксного агглютината и просветлению жидкости в пробирке. Учет результатов
целесообразнее проводить в агглютиноскопе; оценка проводится по 4-балльной
системе.

4. Определение напряженности иммунитета

Под напряженностью иммунитета следует понимать способность организма
рыб противостоять агрессивному влиянию возбудителей болезни и их продуктам
метаболизма и распада (экзо- или эндотоксинам). Напряженность иммунитета
отражает совокупную деятельность всех функциональных структур иммунной
системы рыб на уровне целостного организма.
Одним из объективных способов оценки напряженности иммунитета или
устойчивости рыб к паразитам, вызывающим инфекционные и инвазионные
болезни, является заражение рыб патогенными организмами или их токсинами.
Оценка напряженности иммунитета применяется в селекционной работе, при
определении эффективности вакцинации, последствий влияния благоприятных и
неблагоприятных для жизнедеятельности биотических и абитических (включая
токсические) факторов на выживаемость рыб.

4.1. Методика определения напряженности иммунитета (с ис-
пользованием a.hydrophila)

4.1.1. Принцип метода основан на экспериментальном заражении рыб
вирулентной культурой, вызывающей 50% или 10()%-нуто гибель исследуемого
вида рыб. Причем, в группе рыб с низким уровнем естественной резистентности
ld5o меньше, чем в группе рыб с более высоким уровнем напряженности
естественного иммунитета.

4.1.2. Оборудование и реактивы: аквариумы, пробирки, шприцы, рыба,
суточная культура вирулентных бактерий - возбудителя инфекционной болезни
рыб.

4.1.3. Материал для исследования, ход определения и учет результатов.
Отбирают 60 экз. рыб, имеющих средний для данной партии рыб показатель
навески. В заполненные водой (с температурой не ниже 18°С и не выше 26° С)
пять (и более) аквариумов или бассейнов с аэрацией или садки, установленные в
карантинном пруду, помещают по 25 экз. (из расчета не более 5 г ихтиомассы на 1
л воды) отобранных рыб, которым предварительно вводят внутрибрюшинно
одномиллиардную взвесь суточной вирулентной культуры бактерий a. hydrophila,
приготовленную на 0.65%-ном стерильном растворе натрия хлорида в дозах 0.125;
0.25; 0.5; 0.75; 1 мл (и более). Наблюдение за инфицированной рыбой ведут в
течение 10 суток с момента инъекции микробной взвеси и по вьккивае-мости
устанавливают дозу инфекта, вызывающую 50 или 100%-ную гибель рыб, с
характерными для данной инспекции клиническими и патоло-гоанатомическими
изменениями. Расчет летальной дозы, вызывающей 50%-ную гибель рыб (ld5o),
проводят по методу Рида и Менча (Гончаров, 1973).
Расчитанной дозой ld50 инфекта проводят заражение по 25 экз. исследуемых
рыб, относящихся к одному виду, возрасту, с одинаковой массой, но находящихся
при разных условиях содержания, либо на разных этапах иммуногеиеза, течения
болезни и т.д. Постановку и проведение опыта, а также учет результатов
осуществляют так же, как и при отработке дозы ld5o. Напряженность иммунитета
определяют с учетом процента погибших рыб в опытной группе в сравнении с
контролем.
По окончании аквариумных опытов проводят обеззараживание воды в
аквариумах путем создания в них 10%-ной концентрации формалина или 10%-
ного раствора хлорной извести. Через час воду спускают в канализационную сеть,
а рыб сжигают. Весь инвентарь и посуду, бывшие в употреблении при работе с
больной рыбой, дезинфицируют в 10%-ном растворе формалина в течение часа.
При завершении биологической пробы в бетонированных бассейнах,
земляных садках, карантинных прудах рыбу сжигают и проводят дезинфекцию
воды пугем хлорирования, доводя содержание свободного хлора в воде до 4-5
мг/л. Сутки спустя воду пропускают через известковый фильтр (используют
только свежую негашеную известь). После этого проводят дезинфекцию ложа
прудов или садков и бассейнов негашеной или хлорной известью и оставляют их
без воды на срок не менее месяца. С утверждением настоящих Методических указаний утрачивают силу Методические указания по определению уровней естественной резистентности организма рыб (к инфекционным болезням)", утвержденные ГУВ Госагропрома СССР 13.07.87 №432-3.

Приложение 1
к Методическим указаниям по определению уровня
естественной резистентности и оценке
иммунного статуса рыб, утв. 25 ноября 1999 г.

Уровень фагоцитарной активности лейкоцитов карпа на стадии
поглощения, %

Возраст рыб, время фагоцитоза с момен- та термостатирова-ния или введения Объекта фагоцитоза		Низкий		Средний		Высокий
		Процент фагоцитоза	Фагоцитарный индекс	Процент фагоцитоза	Фагоцитарный индекс	Процент фагоцитоза	Фаго-цитар-ный индекс
сеголетки	15 мин.	6,0+2,0	-	8,0+2,0	-	10 и более	-
	30 мин.	7,0+2,0	0,3+0,2	9,0+2,0	0,6+0,2	11-"-	0,7 и более
	1 час	17,0+4,0	0,8±0,2	21,0+4,0	0,1+0,2	25 -"-	1,2-"-
	1,5 часа	24,0+5,0	1,3+0,2	29,0+5,0	1,5+0,2	34 -"-	1.7-"-
	2 часа	19,0+5,0	1,4+0,2	24,0+5,0	1,6+0,2	29 -"-	1,8-"-
двухлетки	15 мин.	9.0+3,0		12,0+3,0	-	15 -"-	-
	30 мин.	13,0+5,0	0,3+0,2	18,0+5,0	0,5+0,2	23 -"-	0,7 -"-
	1 час	20,0+7,0	0.9+0,2	27,0+7,0	1,1+0,2	34 -"-	1,3-"-
	1,5 часа	28,0+8,0	1,3+0,2	36,0+6,0	1,5+0,2	44.-"-	1,7-"-
	2 часа	27.0+8,0	1,4+0,2	35,0+8,0	1,6+0,2	43 -"-	1,8-"-
трехлетки	15 мин.	9,0+3,0		12,0+3,0	-	15-"-	-
	30 мин.	14,0+5,0	0,4+0,2	19,0+5,0	0,6+0,2	24 -"-	0,8 -"-
	1 час	24,0+6,0	1,0+0,2	30,0+6,0	1,2+0,2	36 -"-	1,4-"-
	1,5 часа	30,0+s,0	1,2+0,4	38,0+8,0	1,6+0,4	46 -"-	2,0 -"-
	2 часа	28.0+8.0	1,4+0,3	36,0+8,0	1,7+0,3	44 -"-	2,0 -"-
4-8-летки	1 5 мин.	10,0+5,0		15,0+5,0	-	20 -".-	-
	30 мин.	15,0+5,0	0,4+0,2	20,0+5,0	0,6+0,2	25 -"-	0,8 -"-
	1 час	22,0+8,0	1,2+0,2	32,0+8,0	1,2+0,2	40 -"-	1,4-"-
	1,5 часа	30,0+9,0	1,2+0-4	39,0+9,0	1,6+0,4	48 -"-	2,0 -"-
	2 часа	29,0+9,0	1,4+0,3	38,0+9,0	1,7+0,3	47 -"-	2,0-"-