Курсовая работа: Цели регенеративной медицины. Терапия стволовыми клетками

Поддержание зрелых клеток крови требует присутствия гемопоэтических стволовых клеток, характеристиками которых являются способность к самообновлению и образование дифференцированного потомства. Предлагается стохастическая модель для механизма самообновления и дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток с использованием in клональной культуральной техники in vitro. Недавний прогресс в молекулярной биологии способствовал изоляции и получению характеристик некоторых цитокинов (IL-1, IL-3, IL-6, IL-11, G-CSF и фактор стволовых клеток factor (SCF)) /42/.

Таким образом, гемопоэтические стволовые клетки способны образовывать не только клетки крови, но и другие типы клеток. В настоящее время создаются способы увеличивающие выход ГСК из костного мозга. ГСК являются важнейшим источником получения собственных стволовых клеток.

2.3 Мезенхимальные стволовые клетки

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) были изолированы из костного мозга, надкостницы, трабекулярной кости, жировой ткани, синовиальной оболочки, скелетной мускулатуры и молочных зубов. Эти клетки обладают способностью дифференцироваться в клетки соединительной ткани, включая кость, жир, хрящ и мускулатуру. Много было выяснено в последние годы об изоляции и характеристиках МСК и о контроле над их дифференцировкой. Эти клетки вызвали большой интерес из-за перспектив их использования в регенеративной медицине и тканевой инженерии. Существуют драматические примеры, взятые из преклинического и клинического использования МСК, которые иллюстрируют их терапевтическую ценность. По мере того, как развивались новые методы, выявлено несколько аспектов взаимодействий имплантированных клеток с хозяином. Они должны быть рассмотрены перед тем, как понять лежащие в их основе механизмы. Взаимодействия м\имплантированных клеток с хозяином включают иммунный ответ хозяина на имплантированные клетки, механизмы хоуминга, которые направляют клетки к месту повреждения, и дифференциация in vivo имплантированных клеток под влиянием локальных сигналов /4/.

Популяции стволовых клеток найдены в большинстве взрослых тканей и в обшем их дифференцирочный потенциал может отражать локальные клеточные популяции. Были описаны гемопоэтические, эпидермальные, мезенхимальные, невральные и гепато - стволовые клетки были. Возможно, что во взрослом организме эти клетки являются резервуаром репаративных клеток, которые мобилизуются повреждением и мигрируют в рану, где в кооперации с локальными клетками участвуют в репаративном ответе. Мезенхимальные стволовые клетки, изолированные из костного мозга, имеют способность дифференцироваться в клетки соединительной ткани. Некоторые разительные примеры терапевтического использования МСК были недавно описаны для таких случакв, как коронарная болезнь артерий, повреждение спинного мозга, болезнь Паркинсона и регенерация печени. В ортопедической медицине МСК применялись для восстановления костей и хряща и при лечении остеоартрита. Вопрос о реакции хозяина на имплантированные МСК становится критическим по мере развития клинических приложений. Есть несколько аспектов взаимодействий имплантированных стволовых клеток с хозяином, которые нужно рассмотреть для понимания механизмов, лежащих в основе терапии стволовыми клетками. Это (1) иммунный ответ хозяина на имплантированные клетки, (2) механизмы хоуминга, которые направляют клетки к месту повреждения, (3) дифференциация имплантированных клеток под влиянием локальных сигналов /3/.

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) являются предшественниками всех клеток соединительной ткани. МСК были изолированы из костного мозга и других тканей у взрослых множества видов позвоночных. Они размножались в культуре и диффренцировались в несколько ткань - образующих клеток, таких, как кость, хрящ, жир, мускулатура, сухожилие, печень, почки, сердце, даже клетки мозга. Последние достижения в практическом применении МСК при регенерации человеческого суставного мыщелока синовиального сустава являются примерами их функциональности и многосторонности /1/.

Таким образом, мезенхимальные клетки при дифференцировке образуют различные клетки соединительной ткани.

2.4 Стромальные стволовые клетки

Созданы линии человеческих мезенхимальных стволовых клеток, которые могут дифференцироваться в различные тканевые клетки, включая кость, нервные клетки, стромальные клетки костного мозга, поддерживать рост гемопоэтических стволовых клеток и так называемых “стромальных опухолевых клеток”, смешанных с опухолевыми клетками. Обладающие теломеразой человеческие стромальные клетки из костного мозга обладают повышенной продолжительностью жизни и поддерживают рост гемопоэтических клоногенных клеток. Перенос гена индийского ежа (дикобраза) существенно увеличил экспансию гемопоэтических стволовых клеток, поддерживаемую человеческими стромальными клетками костного мозга. Генномодифицированные мезенхимальные стволовые клетки полезны, как терапевтические инструменты для лечения повреждения мозговых тканей (например, в результате инфаркта мозга) и злокачественных мозговых неоплазм. Трансплантация мезенхимальных стволовых клеток защищает мозг от острого ишемического повреждения при окклюзии среднемозговой артерии на животной модели. Полученный из мозга нейротропный фактор (BDNF) - генной трансдукции еще больше увеличил протективную эффективность против ишемического повреждения. Мезенхимальные стволовые клетки обладают отличной способностью к миграции и оказывают ингибиторный эффект на клетки глиомы. Генная модификация мезенхимальных стволовых клеток терапевтическими цитокинами увеличивает антиопухолевый эффект и пролонгирует выживание животных с опухолями. Генная терапия, использующая мезенхимальные стволовые клетки, как тканепротективный и направленный цитореагент является многообещающим подходом /21/.

Этот обзор посвящен стволовым клеткам костного мозга. Методы индентификации, культивирования, накопления клеточной массы и пересадки стволовых клеток описаны, включая выделение линий гемопоэтических и мезенхимальных линий стволовых клеток и детальный анализ, использующий многочисленные CD и другие маркеры для идентификации малых субпопуляций стволовых клеток. За секцией, посвященной стволовым клеткам крови пуповины, следует детальное обсуждение современной ситуации в клиническом использовании стволовых клеток, его последние неудачи, связанные с эпигенетическими факторами, различные подходы к открытию высокомультипотентных стволовых клеток костного мозга, и краткое описание эмбриологических подходов к идентификации базовых стволовых клеток костного мозга на самых ранних стадиях развития эмбрионов млекопитающих /16/.

Костный мозг взрослых млекопитающих содержит не одну, а две отдельные популяции взрослых стволовых клеток. Первой и наиболее хорошо охарктеризованной является популяция гемопоэтических стволовых клеток, ответственная за поддержание продукции в течение всей жизни клеток крови. Биологические характеристики и свойства второй резидентной популяции стволовых клеток костного мозга, называемых стромальными клетками костного мозга или мезенхимальными стволовыми клетками, значительно менее понятны. In vitro культуры, произошедшие из суспензии разделенного на отдельные клетки костного мозга различных видов млекопитающих, образуют колонии стромальных клеток костного мозга, каждая из которых происходит от одной клетки - предшественника, называемой колониеобразующий фибробласт. Были разработаны условия культивирования для выращивания стромальных клеток костного мозга in vitro, которые сохраняли способность дифференцироваться в кость, жир и хрящ. Значительная доля современных знаний об этой популяции клеток базируется на анализе свойств этих культур клеток, а не на свойствах первичных инициирующих рост колонии клеток. Современные данные заставляют предположить, что стромальные прогениторы в костном мозге in situ ассоциированы с внешней поверхностью сосудов и могут делить идентичность с сосудистыми перицитами /51/.

Таким образом, стромальные стволовые клетки костного мозга являются одним из видов мезенхимальных стволовых клеток.

2.5 Тканеспецифичные стволовые клетки

Полагают, что стволовые клетки важны для регенерации нескольких взрослых тканей. В последнее время были идентифицированы взрослые стволовые клетки с очень широким потенциалом дифференцировки, хотя не известно представляют ли они примитивные стволовые клетки или продукты исключительно редких событий дедифференцировки, включающие тканевоспецифичные стволовые клетки. Была также продемонстрирована трансдифференцировка тканевоспецифичных стволовых клеток за границы линии, но относительная неэффективность процесса in vivo, даже в присутствии тканевого повреждения, подвергает сомнению физиологическое значение такого механизма. Интересно, что среди взрослых стволовых клеток. которые культивируются ex vivo продолжительные периоды времени, способность изменять линию наибольшая. Если решения о судьбе нормальных разнообразных стволовых клеток могут быть изменены с высокой частотой in situ, могут быть представлены возможные регенеративные терапии для большого разнообрзия болезней. Интегральное понимание транкрипционной регуляторной сети, которая включает различные взрослые стволовые клетки, также, как и сигнальных путей, управляющих их дифференцировкой в терапевтически полезные клеточные типы, будет способствовать клиническому приложению этих волнующих открытий /8/.

Таким образом, тканевоспецифичные стволовые клетки способны дифференцироваться в другие типы клеток, но in vivo этот процесс малоэффективен. Тем не менее сейчас разрабатываются подходы, сделающие возможным использования этого источника стволовых клеток.

3. Ангиогенные стволовые клетки

Открывшаяся в настоящее время возможность изолировать стволовые клетки и изучать их специфичную способность самообновления с образованием различных клеточных типов открыла волнующую перспективу помочь восстановлению поврежденной ткани, и даже образования новых тканей. Процесс васкулогенеза (васкуляризация ишемических или инжиниринговых тканей) сходен с эмбриональным процессом в котором “гемангиобласты" дифференцируются в клетки крови, также как в примитивные сосуды. Хотя и обусловленный клетками происходящими из костного мозга, во взрослой жизни васкулогенный восстановительный механизм вносит лишь небольшой вклад в механизмы восстановления сосудов: а именно (i) ангиогенез (рост сосудов из существующих сосудов); и (ii) артериогенез (направляемое моноцитами увеличение калибра существующих артериолярных коллатералей). Большинство попыток увеличить восстановление сосудов с помощью стволовых клеток проходило с использованием факторов роста, которые мобилизовывали стволовые клетки из костного мозга в кровь, иногда комбинированное с изоляцией и реинфузией этих клеток после экспансии и дифференцировки ex vivo в эндотелиальные клетки - предшественницы. Четкое улучшение перфузии областей ишемии и васкуляризации наблюдалось in vivo в основном на животных моделях. Периферический хоуминг и его регуляция, а также (конечная) дифференцировка в местах восстановления сосудов менее изучены, но имеют первостепенное значение для эффективности и безопасности. Использование эмбриональных стволовых клеток встречает этические возражения. Более того, специальное внимание и меры требуются для того, чтобы преодолеть аллогенные барьеры, с которыми обычно сталкиваются эти клетки. В общем, длительное и сложное ex vivo культивирование, требующиеся для получения достаточного потомства от весьма небольшого числа стволовых клеток для использования в качестве стартового материала, дорого и обременительно. Как фундаментальные исследования концептуальных вопросов, так и работа по эффективному удешевлению продукта должны пройти долгий путь перед клиническим использованием в клинике/63/.

Таким образом, ангиогенные стволовые клетки происходят из костного мозга.

4. Рекрутирование (мобилизация) стволовых клеток

Высокомобильный групповой белок 1 (High mobility group box 1) (HMGB1) является негистоновым белком, требующемся для поддержания архитектуры хроматина. Последние исследования показали, что он может действовать, как цитокин, регулирующий различные биологические процессы, такие, как воспаление, миграция клеток и метастазирование. Ранее показано, что HMGB1 может пассивно освобождаться клетками, которые погибают в результате травмы или непрограммируемым путем, и может быть сигналом повреждения тканей. HMGB1 может рекрутировать стволовые клетки: HMGB1 индуцирует стволовые клетки к трансмиграции через эндотелиальный барьер, более того, когда шарики, содержащие HMGB1 имплантировали в здоровый мускул, они рекрутировали стволовые клетки, введенные в общую циркуляцию. Роли HMGB1 в воспалении и в регенерации тканей могут быть строго взаимосвязаны /43/.

Мобилизация гемопоэтических стволовых клеток и клеток - прогениторов из костного мозга в циркуляцию повторяющимися ежедневными стимуляциями только G-CSF или в комбинации с циклофосфамидом все шире используется в клинике; однако механизм этого все еще не до конца понят. Более того, вслед за мобилизацией стволовые клетки возвращаются назад в костный мозг, что заставляет предположить, что освобождение/мобилизация и хоуминг представляют собой последовательные события со своими физиологическими ролями. Ранее была определена роль для мобилизации стволовых клеток цитокинов, таких, как G-CSF SCF, и молекул адгезии, таких, как VLA-4 и P/E селектины. Результаты последних исследований с использованием моделей на экспериментальных животных и клинические протоколы мобилизации продемонстрировали важное участие хемокинов, таких, как происходящий из стромы фактор 1 (stromal derived factor-1 (SDF-1)) и интерлейкин-8, также, как эластаза и катепсин G в процессе мобилизации /29/.

CD34 (+) гематопоэтические стволовые клетки из периферической крови обычно используются для аутологичной или аллогенной трансплантации, следующей за терапией высокими дозами при злокачественных заболеваниях. Применение таких гемопоэтических факторов, как G-CSF, сильно увеличивает мобилизацию CD34 (+) клеток. Механизм мобилизации стволовых клеток все еще не ясен. Похоже, что это многоступенчатый процесс с участием цитокинов и молекул адгезии. Важную роль в мобилизации и хоуминге CD34 (+) клеток играют гемопоэтические факторы роста, хемокины и молекулы адгезии CD34 (+) клеток. Лекарства, такие, как моноклональные антитела, специфические пептиды или олигонуклеотиды, имеют целью молекулы адгезии /28/.

Мобилизация гемопоэтических прогениторных клеток, как оказалось, является мультифакторным процессом, который, по крайней мере частично, регулируется на уровне микроваскулярного эндотелия костного мозга (МВЭКМ). С целью изучения регуляции миграции прогениторных клеток эндотелием in vitro были развиты методы изоляции МВЭКМ из аспиратов костного мозга. Обретшие бессмертие МВЭКМ клеточные линии были сгенерированы. При использовании модели миграции через эндотелий костного мозга in vitro показано, что только небольшое число более зрелых, дифференцированных прогениторных клеток мигрируют спонтанно. В этой модели участвуют молекулы адгезии семейства бета2-интегрина и соответствующие им эндотелиальные лиганды. Низкая спонтанная миграционная способность предполагает, что дополнительно к молекулам адгезии, которые опосредуют прямые клеточные контакты, паракринные цитокины и хемокины могут играть роль в миграции прогениторных клеток через эндотелий. Стимулированные фактором роста гемопоэтические клетки могут продуцировать цитокины, которые действуют на эндотелиальные клетки (сосудистый эндотелиальный фактор роста - VEGF), модифицируя их подвижность, рост, проницаемость и распределение. Поэтому VEGF может участвовать в мобилизации и хоуминге гемопоэтических стволовых клеток. Более того, трансэндотелиальная миграция прогениторных клеток in vitro существенно увеличивается хемокином из стромы stromal-cell-derived factor-1 (SDF-1), который продуцируется стромальными клетками костного мозга. Более примитивные прогенаторы, которые не мигрируют спонтанно, также реагируют на хемокин. Сделан вывод, что трасэндотелиальная миграция прогениторных клеток регулируется молекулами адгезии, паракринными цитокинами и хемокинами. Stromal-cell-derived factor-1 (SDF-1), мобилизующие гемопоэтические факторы роста стимулируют пролиферацию гемопоэтических клеток, которая может о приводить к изменениям в локальной “атмосфере” цитокинов и хемокинов непрямым образом и в конце концов приводить к мобилизации гемопоэтических прогениторных клеток /37/.

Гемопоэтические прогениторные клетки, мобилизуемые в переферическую кровь, теперь широко используются в трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток для лечения ряда злокачественных и некоторых незлокачественных болезней. Хотя изначально использовалась только химеотерапия, все современные протоколы лечения в настоящее время включают использование цитокинов, с или без химеотерапии. Развитие получила предварительная терапия рака с целью получения урожая прогениторных клеток, расширились знания о кинетике мобилизации и совершенствовались необходимые навыки в собирании и криоконсервации прогениторных клеток. Для предсказуемого исхода Более аккуратные измерения числа гемопоэтических прогениторных клеток и определение необходимого их количества для оптимального выздоровления после терапии высокими дозами химиопрепаратов были разработаны. Хотя использование G-CSF обычно оказывается успешным, у некоторых пациентов не удается добиться достаточной мобилизации или требуется дополнительное число отборов клеток. Клинические исследования цитокинов раннего действия, фактора стволовых клеток в комбинации с G-CSF продемонстроровали увеличенный выход прогениторных клеток у ряда пациентов, что может дать клинические преимущества в избранных ситуациях. На животных моделях, и в меньшей степени у людей, другие цитокины, такие, как тромбопоэтин и Flt-3 лиганд или некоторые малые молекулы с единичной или множественной активностью агонистов для цитокиновых рецепторов (IL-3, Flt-3L, TPO, G-CSF) также оказались многообещающими мобилизационными агентами. Дальнейшие исследования относительной важности клеточной пролиферации, клеточной адгезии и роли вспомогательных клеток и других сигнальных событий ведут к улучшению понимания механизмов, лежащих в основе мобилизации гематопоэтических прогениторных клеток. Введение надлежащей химиотерапии высокими дозами вслед за реинфузией гематопоэтичесих прогениторных клеток, способных к длительной существованию, уже давно применяется в лечении ряда злокачественных (преимущественно гематологических) и незлокачественных болезней. В течение многих лет прогениторные клетки получали прямой аспирацией костного мозга при анестезии, отсюда термин трансплантация костного мозга. Однако было достигнуто понимание, что гемопоэтические стволовые клетки можно получать из периферической крови, хотя и в небольших количествах, а также из пуповинной крови. Дальнейшее эмпирическое изучение показало, что число гемопоэтических прогениторных клеток, циркулирующих в крови, может быть временно увеличено после химеотерапии и/или введения одного или нескольких цитокинов. Улучшения клинической практики мобилизации прогениторных клеток, сбора и размножения клеток оказались столь успешными, что во многих случаях стволовые клетки крови заместили костный мозг, как предпочтительный источник /19/.

Таким образом, в процессе мобилизации стволовых клеток принимают участие некоторые белки хроматина, цитокины, хемокины и молекулы адгезии.

5. Пролиферация стволовых клеток

Вклад стволовых клеток в ранние фазы гемопоэтической трансплантации противоречив, также как и вопрос о числе стволовых клеток, необходимых для успешной длительной трансплантации у человека. Существует большое количество данных для мышей, но степень обоснованности их переноса на человека дискуссионна. Другие варьирующие показатели, касающиеся стволовых клеток, включают их эффективность в хоуминге в костный мозг, их предыдущая пролиферативная история, влияющая на длину теломеров и их способность усиливать активность теломеразы. Степень увеличения числа стволовых клеток in vivo после трансплантации или ex vivo после стимуляции цитокинами обсуждается и поднят вопрос о нестохастических внешних влияниях для изменения вероятности самообновления стволовых клеток /38/.

Гематопоэтические стволовые клетки (ГСК) образуют все клетки крови и иммунные клетки и используются в клинических протоколах по трансплантации для лечения разнообразных заболеваний. Способность увеличивать число ГСК vivo или in vitro обеспечит новые возможности для лечения, но амплификации ГСК было трудно достигнуть. Понимание механизмов самообновления ГСК сделало амплификацию ГСК важной клинической целью /53/.

Микроокружение костного мозга представляет собой сложную трехмерную структуру, где гемопоэтические клетки пролиферируют, приобретают зрелость, мигрируют в синусоидальное пространство и выходят в циркуляцию регулируемым образом. Стромальные клетки в микроокружении костного мозга обеспечивают подходящее окружение для самообновления, пролиферации и дифференцировки гемопоэтических клеток. Внутри гемопоэтического микроокружения существует эмбриональный желточный мешок, зародышевая печень или взрослый костный мозг. Микроваскулярный эндотелий не только действует, как сторож ворот, контролирующий траффик и хоуминг гемопоэтических прогенаторов, но также обеспечивает клеточный контакт и секретирует цитокины, которые разрешают сохранение устойчивого состояния гемопоэза. В последнее время гомогенные слои эндотелиальных клеток костного мозга были изолированы и культивировались в условиях клеточной культуры. Длительные культуральные исследования показали, что монослои эндотелиальных клеток костного мозга являются уникальным типом эндотелия и могут поддерживать длительную пролиферацию гемопоэтических прогенаторных клеток, в особенности мегакариоцитов и миелоидных прогенаторных клеток путем выработки линия - специфичных цитокинов, таких, как G-CSF, GM-CSF, M-CSF, Kit-лиганд, IL6, FLK-2 лиганд и ингибиторный фактор лейкемии. Прямые клеточные контакты между гемопотическими прогенаторными клетками и эндотелиальными клетками костного мозга через специфические молекулы адгезии, включающие бета1, бета2 интегрины и селектины играют критическую роль в траффике и возможно пролиферации гемопоэтических стволовых клеток. Дисфункции микрососудистых эндотелиальных клеток в гемопоэтическом микроокружении могут приводить к расстройствам функции стволовых клеток и прогрессировании пластических анемий, а также вносят вклад в нарушения приживления трансплантанта при трансплантации костного мозга. Дальнейшее изучение роли микроваскулярного эндотелия в регуляции хоуминга гематопоэтических клеток может увеличить наше знание о патофизиологии стволовых клеток и лейкемии /47/.

Страницы: 1, 2, 3