Курсовая работа: Механизмы проникновения вирусов в клетку. Биохимические и цитофизиологические аспекты

В последнее десятилетие в мембранах клеток млекопитающих исследователями были обнаружены микродомены, размером 40--50 нм, диффузно связанные с липидами. Эти участки преимущественно состоят из высокоорганизованных насыщенных липидов и холестерола, который латерально подвижен относительно второго уровня ненасыщенных липидов мембраны. При формировании инвагинаций плазмалеммы ограничение поглощенного материала в таких микроучастках происходит с помощью холестерола. Уникальный липидный состав участков, определяющих местоположение микродоменов, является физической основой для специфической сортировки белков мембраны, а гликолипиды составляют для них трансмембранную область.

·  Кавеолин- и клатрин-независимый эндоцитоз. Исследования последних лет позволили отнести липидные участки клеточной мембраны к специфическому механизму эндоцитоза, в котором не используются кавеолин и клатрин. Описано несколько маркеров для этих липидных участков клеточной мембраны, такие как субблоки связанные с липидами бактериальных токсинов, а также рецепторы мембраны - гликосфинголипиды GM1, Gb3 и другие. С помощью ультрастуктурных и биохимических исследований установлен клатрин-независимый эндоцитоз интерлейкина 2 в лимфоцитах, который конститутивно возможен при наличии рецептора к этому цитокину. Это подтверждает известный факт, что лимфоциты лишены кавеолина и имеют рецептор к IL-2

Необходимо отметить роль динамина, который используется клетками при фагоцитозе, кавеолин- и клатрин-опосредованном эндоцитозах, а также в независимых от этих белков видах эндоцитоза. Этот протеин выступает как регулятор мембранного перемещения на поверхности клетки, является ГТФазой, молекулярной массой 100 кДа, и содержит несколько доменов, которые поддерживаются фосфотидилинозитол -4,5-бифосфатными связями. Информация о динамине закодирована в его собственном ГТФаз-активиру ющем белке внутри ГТФ-эффекторного домена. В поздней стадии формирования везикул при взаимодействии ГТФазного эффекторного домена с другим концевым доменом – аргинином, динамин преобразуется в гексагональную кольцевую структуру типа «воротника», который отшнуровывает вакуоль от плазмалеммы. Тем не менее, точная функция динамина еще не определена, и на настоящий момент существуют 2 модели механизма его воздействия на отделение везикул от мембраны. Соответственно первой, динамин в отличие от остальных членов семейства ГТФаз может функционировать как механохимический фермент, при гидролизе ГТФ структурно сжимаясь. В этом случае динамин физически преобразуется в очень плотную структуру и как своеобразный жгут отшнуровывает везикулы от мембраны. Вторая, основана на наблюдениях, указывающих, что спираль, образованная динамином в присутствии ГТФ имеет большие промежутки. Это предполагает, что динамин действует как молекулярная пружина, проталкивая сформированную везикулу через цитозоль.

Как уже упоминалось выше, процесс перемещения вирусного генома и сопутствующих белков через мембрану клетки-хозяина называется пенетрацией или проникновением. Эволюция не создала для вирусов специфических структур, обеспечивающих их вход в клетку, и поэтому они используют клеточные рецепторы и порталы, существующие для проникновения жизненно-важных компонентов при нормальном функционировании клетки. Так, показано, что вирусы для входа в клетки-хозяева используют все эндоцитарные пути, включая клатрин-, кавеолин-опосредованные и недавно описанные независимые от этих белков виды эндоцитоза, а так же макропиноцитоз. Известны вирусы, которые могут проникать в клетки двумя механизмами, как с помощью эндоцитоза, зависимого от клатрина и кавеолина, так и путем, независимым от этих белков.

Для разграничения вирусов в зависимости от механизма проникновения в данной работе была использована вышеобозначенная классификация порталов для проникновения биологически активных веществв клетки (см. далее таблицу). Необходимо отметить, что некоторыми исследователями наряду с указанными механизмами входа вирусов также выделяются холестерол- и динамин-зависимые виды эндицитоза, но так как очень часто эти белки используются клеткой на различных этапах перемещения эндоцитарных везикул, то, возможно, нецелесообразно выделять последние два вида эндоцитоза.

Если рассматривать широкий спектр вирусов, то большинство из них для своего проникновения используют путь клатрин- опосредованного эндоцитоза (таблица). Данный путь физиологически наиболее эффективен, так как в этом случае вирусы защищены от воздействия на них биологически активных веществ цитоплазмы клеточной мембраной, формирующей эндоцитарную вакуоль. В пределах вакуоли вирусные частицы могут перемещаться и проникать в более глубокие области цитоплазмы с помощью механизма, получившего название "груз" - "cargo". Этот механизм осуществляется опосредовано через микротрубочки и используется для перемещения частиц размером больше 20 нм, так как из-за большого размера физические свойства цитоплазмы не позволяют самостоятельно везикулам свободно диффундировать. В этот процесс вовлекаются три различных класса биомолекул-моторов: кинезин, динеин и миозин.

Семейства вирусов	Механизмы проникновения
	"Неодетые" вирусы без суперкапсида
Пикорнавирусы
Полиовирус	Слияние вирусной оболочки и плазмалеммы клеток
	и динамин-независимый эндоцитоз
Вирус ЕСН01	Кавеолин-опосредованный эндоцитоз
род Пареховирусов,	Клатрин-опосредованный эндоцитоз
Риновирус человека 2 и 14	Клатрин-опосредованный эндоцитоз
Риновирус человека 2	Слияние вирусной оболочки и плазмалеммы клеток
Реовирусы
Ротавирус человека	Клатрин-опосредованный эндоцитоз и эндоцитоз, независимый
	от клатрина и кавеолина
Паповавирусы
Вирус обезьян 40	Кавеолин-опосредованный эндоцитоз
Вирус полиомы	Кавеолин-опосредованный эндоцитоз
Вирус папилломы коров	Слияние вирусной оболочки и плазмалеммы клеток
Вирус папилломы человека	Клатрин-опосредованный эндоцитоз
тип 16 и 58
Парвовирусы	Клатрин-опосредованный эндоцитоз
Парвовирус псовых	Клатрин-опосредованный эндоцитоз
Минутный вирус мышей	Клатрин-опосредованный эндоцитоз
Аденовирусы
Аденовирус 5	Клатрин-опосредованный эндоцитоз
Аденовирус 2	Клатрин-опосредованный эндоцитоз и эндоцитоз независимый
	от клатрина и кавеолина
Аденовирус 2	Эндоцитоз независимый от клатрина и кавеолина
Аденовирус человека	Клатрин-опосредованный эндоцитоз и эндоцитоз независимый
	от клатрина и кавеолина
Поксвирусы
Вакцинный вирус	Макропиноцитоз и слияние вирусной оболочки и плазмалеммы
	клеток
Реовирусы
Инфекционные субвирусные	Клатрин-опосредованный эндоцитоз
частицы
	"Одетые'' вирусы с наличием суперкапсида
Филовирусы
Вирус Марбурга	Кавеолин-опосредованный эндоцитоз
Вирус Эбола	Кавеолин-опосредованный эндоцитоз
Коронавирусы
Коронавирус человека	Кавеолин-опосредованный эндоцитоз
Алъфавирусы
Вирус леса Семлики	Клатрин-опосредованный эндоцитоз
Синбис вирус	Клатрин-опосредованный эндоцитоз
Флавивирусы
Вирус клещевого энцефалита	Клатрин-опосредованный эндоцитоз
Вирус японского энцефалита	Клатрин-опосредованный эндоцитоз
Вирус западного Нила	Клатрин-опосредованный эндоцитоз
Семейства вирусов		Механизмы проникновения
Ортомиксовирусы
Вирус гриппа А		Клатрин-опосредованный эндоцитоз и клатрин-независимый эндоцитоз
Рабдовирусы
Вирус везикулярного стоматита		Клатрин-опосредованный эндоцитоз
Буньявирусы
Вирус La Crosse		Клатрин-опосредованный эндоцитоз
Хантавирус		Клатрин-опосредованный эндоцитоз
Иридовирусы
Вирус африканской лихорадки свиней		Клатрин-опосредованный эндоцитоз
Тогавирусы
Вирус краснухи		Клатрин-опосредованный эндоцитоз
Парамиксовирусы
Вирус мозаики		Слияние вирусной оболочки и плазмалеммы клеток
Ортогепаднавирусы
Вирус черного гепатита В		Клатрин-опосредованный эндоцитоз
Вирус гепатита мыши 4		Клатрин-опосредованный эндоцитоз и слияние вирусной оболочки и плазмалеммы клеток
Ретровирусы
Вирус иммунодефицита человека		Макропиноцитоз и слияние вирусной оболочки и плазмалеммы клеток
Вирус лейкоза		Клатрин-опосредованный эндоцитоз
Герпесвирусы
Вирус простого герпеса 1		Слияние вирусной оболочки и плазмалеммы клеток
Вирус простого герпеса 1		Клатрин-опосредованный эндоцитоз
Вирус герпеса 4 Эпстайна-Барр		Слияние вирусной оболочки и плазмалеммы клеток и клатрин-опосредованный эндоцитоз
Вирус герпеса 1 и 5 у коров		Слияние вирусной оболочки
Цитомегаловирус		Клатрин-опосредованный эндоцитоз
Вирус герпеса 8 (вирус саркомы Капоши)		Клатрин-опосредованный эндоцитоз
Бакуловирусы		Клатрин-опосредованный эндоцитоз и макропиноцитоз
Артеривирусы
Вирус респиративного синдрома у свиней		Клатрин-опосредованный эндоцитоз

Принято, что для "одетых" вирусов с наличием суперкапсида проникновение осуществляется путем слияния их оболочки с плазмалеммой клетки либо путем рецептор-опосредованного эндоцитоза. Последний используют вирус леса Семлински и вирус гриппа А. Механизм прямого слияния с плазмалеммой характерен для вируса Сен-дай и некоторых ретровирусов. Различие механизмов слияния клеточной мембраны с суперкапсидом вирусов определяется наличием у них интегральных гликопротеинов - белков слияния. Они отличаются способом активации и структурными особенностями, и их функционирование зависит от присутствия трансмембранных гликопротеинов.

Исследование структур и функций белков слияния позволило разделить их на два класса по радиально отличающейся архитектонике. Конформационные изменения эктодоменов этих белков обеспечивают процесс слияния с мембраной клетки. Предполагается, что расширенный трехнитевой стержень белков является α-спиральным и имеет сходство с общей структурой и функциями эктодоменов белков слияния различных вирусов, имеющих суперкапсид. Таким образом, отмечаются общие черты процесса слияния вирусной оболочки с плазмалеммой при проникновении различных вирусов этой группы в клетки. В этом случае при активации стабильный белок слияния пространственно изменяется и приобретает стержневидную форму, подобную "шпильке", которая внедряется в определенный участок клеточной мембраны. Затем обратная сторона белка слияния складывается на начало, тем самым, заключая белок слияния и трансмембранную область в себя, что приводит к близкому контакту вирусной оболочки и мембраны. В этом процессе в основном участвуют липиды плазмалеммы. В дальнейшем, происходит образование локальной полусферы с последующим открытием и увеличением поры в клеточной мембране для передачи вирусных компонентов.

Недавние исследования показали, что при последней стадии слияния суперкапсида вирусов с плазмалеммой, т.е. при формировании и увеличении поры слияния, необходимы определенные клеточные трансмембранные области минимальной длины. При этом не определена временная зависимость процесса формирования поры слияния от точной последовательности химической структуры подобной трансмембранной области, но есть необходимость в ее определенных функциональных свойствах. Такие липидные участки плазмалеммы, используемые вирусами как платформы для входа, обеспечены локализованной концентрацией рецепторов и/или сопутствующими им корецепторными комплексами, а также другими компонентами клетки, которые модулируют процесс входа. Эти участки имеют определенное значение для завершения процесса слияния суперкапсида вируса с плазмалеммой, особенно физические свойства липидов, составляющие участок контакта с оболочкой вируса. При этом также имеет определенное значение структурный состав вирусного суперкапсида. Так, в случае, если в нем преобладают липиды, для входа вируса отпадает необходимость в трансмембранных участках плазмалеммы. Указываются некоторые исключения, когда при проникновении вируса в клетки при функционировании вирусных белков слияния не используются его внутренние домены.

 Исследования последних лет установили, что при конформационных изменениях вирусных белков слияния используется энергия клетки-хозяина, и эти белки внедряются в нестабильные области липидного бислоя мембраны. При этом, объединяется проксимальный монослой липидов, окружающий измененный стержень белка при формировании полусферы слияния. Это впоследствии генерирует формирование липидной поры, завершая тем самым процесс слияния оболочки вируса и плазмалеммы. Представляют интерес последние исследования недавно открытых специфических микродоменов в биологических мембранах, которые названы "плотами" (raft). Название подобных микродоменов определяется их свойством перемещаться, как бы плавая, в мозаичном липидном слое мембран.

На моделях биологических мембран показано, что в присутствии холестерола сфинголипиды формируют микродомены - "плоты" - путем организации из дизорганизованной жидкостной фазы мембраны (Lc) в жестко-жидкостное кристаллическое состояние (Lo). Свойство этих микродоменов мобильно перемещаться в мембране определяет их функции в клетках. Так, они способны перемещать специфические белки от внутренних клеточных мембран к внешним и наоборот, от аппарата Гольджи к поверхности клеток, а также принимать участие в эндоцитозе. Эти функции определяют значение микродоменов в этапах жизненного цикла вируса в клетке-хозяине, таких как его входе, сборке новообразованных вирусных частиц и их перемещении к поверхности клетки.

Доказано участие "плотов" клеточной мембраны в процессе проникновения группы вирусов, имеющих суперкапсид. Так, выявлено присутствие вирусных гликопротеинов в этих структурах и обнаружено взаимодействие их с липидными компонентами "плота", а удаление холестерола ингибировало вирусное проникновение. Установлено, что гликопротеины некоторых вирусов, включая вирус гриппа, вирус иммунодефицита человека, вирус Эбола и другие, способны ассоциироваться с "плотами" клеточной мембраны. Также филовирусы Эбола и Марбурга проникают в клетки путем кавеолин-опосредованного эндоцитоза, при котором белок кавеолин связан с микродоменами плазмалеммы. Механизм проникновения вирусов путем эндоцитоза, независимого от клатрина и кавеолина и опосредованного липидными площадками плазмалеммы - "плотами", главным образом, осуществляется в клетках неспособных к синтезу этих белков. Этот путь используют некоторые пикорнавирусы, вирусы папилломы, филовирусы и ретровирусы (таблица). На примере ретровирусов было показано, что при этом механизме связывание трансмембранных рецепторов с белками вирусной оболочки приводит к быстрому формированию выемок на поверхности плазмалеммы, которые затем преобразуются в везикулы.

Необходимо отметить особенное значение рН участка, окружающего пору слияния вирусной оболочки с плазмалеммой. Так, активация белков слияния вирусов иммунодефицита человека и Эбола происходит при нейтральном значении рН. Конформационные изменения белков слияния других вирусов могут инициироваться кислым значением рН, и в этом случае вирусные частицы подвергаются эндоцитозу до начала процесса слияния с плазмалеммой. К таким вирусам относятся альфавирус леса Семлики, вирус Синдбис и другие.

Большинство "неодетых" вирусов без суперкапсида присоединяются к рецепторам и интернализируются в цитоплазму клеток посредством эндоцитоза. Механизмы проникновения этих вирусов мало изучены. Тем не менее, недавние исследования с помощью высокоразрешающей криоиммунной электронной микроскопии показали, что полиовирус, связываясь с рецепторами плазмалеммы, пространственно трансформируется из структуры 160S в 135S. Подобная пространственная конформация позволяет белкам нуклеокапсида взаимодействовать с мембраной клетки для формирования поры. Затем дополнительные конформационные изменения вирусной частицы сопутствуют проникновению ее геномной РНК в цитоплазму клетки, и на поверхности плазмалеммы остается опустошенная частица 80S. При этом структурно-измененная 135S полиовирусная частица интернализируется в цитоплазму клетки путем эндоцитоза, независимого от клатрина и кавеолина, с использованием актина и тирозина. Реализация геномной вирусной РНК происходит только после ее выхода из эндосомы, которая ограничена мембраной клетки и имеет размер 100-200 нм. Пустой капсид 80S транспортируется микротрубочками в цитоплазму клетки. Для проникновения "неодетых" вирусов некоторых семейств, включая пикорнавирусы, не требуется низкое значение рН. Также отмечается участие липидных площадок плазмалеммы - "плотов", о которых упоминалось выше, в процессе проникновения "неодетых" вирусов. Так, показано, что инфицирование клеток многими пикорнавирусами, а именно, вирусом ЕСНО11, энтеровирусом 70, вирусами Коксаки В и А21, зависит от холестерола и актина цитоскелета клетки-хозяина. Подобный механизм проникновения обнаружен и для вирусов семейства Папова.

Как уже указывалось выше, в процессе проникновения различных веществ в клетку активное участие принимают белки семейства ГТФаз. Непосредственно в процессе эндоцитоза используются белки Rab5, необх6димые при формировании ранних эндосом, Rab7, принимающие участие в формировании ранних и поздних эндосом, Rab4 и Rab 11, вовлекающиеся в рециркуляцию везикул, а также Rab9, контролирующие перемещение эндосом к аппарату Гольджи. Установлено, что все эти белки принимают активное участие в процессе вирусного проникновения, и при использовании маркеров на эти белки можно исследовать молекулярный механизм такого перемещения вирусов. Например, было выявлено, что присутствие Rab5 оказывает влияние на проникновение аденовирусов, различающихся по вирулентности, а использование Rab7 позволило определить локализацию аденовируса подгруппы В в поздних эндосомах, тогда как аденовирус подгруппы С в этих органеллах не присутствует, но обнаруживается в ранних эндосомах. Также известно, что эндоцитоз опосредуется киназами и при присоединении аденовируса к интегринам плазмалеммы задействуются эти ферменты.

Макропиноцитозный путь используется клетками для поглощения большого количества жидкости и веществ, в них растворенных]. Большие вакуоли формируются путем закрытия выростов плазмалеммы, и этот процесс зависит от актина и динамина. Этот путь для своего проникновения используют такие вирусы, как вирус иммунодефицита человека в макрофаги, аденовирус второго типа и вакцинный вирус семейства Поксвирусов.

Итог

Таким образом, за последние годы кардинально изменились представления о механизмах входа вирусов в клетку. Причем, в литературе указывается, что очень часто вирусы для выхода из клетки используют такой же механизм, с помощью которого они в нее проникли. Тем не менее, до настоящего времени детально не исследована молекулярная структура рецепторов и их химический состав, как у клеток, так и у вирусов. Известно, что активация сигнального каскада в клетке-хозяине, инициированного адгезией и присоединением к рецепторам ее плазмалеммы биомолекул, находящихся на поверхности вируса, определяет дальнейшее перемещение клеточных органелл, контролируемое различными молекулами. В дальнейшем, в зависимости от этого процесса осуществляется интернализация вирусных частиц в цитоплазму клетки. Поэтому, изучая поэтaпно процесс перемещения вирусной частицы от наружной поверхности плазмалеммы в цитоплазму клетки с привлечением современных методов иммуноэлектронной и конфокальной микроскопии, можно анализировать, каким образом и с помощью каких молекулярных посредников вирусы способны управлять перемещением клеточных мембран и органелл. Подобные исследования· смогут обеспечить понимание не только процесса инфицирования и стратегии вирусного заражения клетки, но и возможность воздействия на этот процесс с целью определения терапевтических подходов для лечения вызываемых ими заболеваний.

Список литературы

1.  Современные представления о механизмах входа вирусов в клетку. Н.Г. Плехова, Л.М. Сомова. Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, Владивосток. Успехи современной биологии. 2009. Т. 129. № 1. С. 39-50.

2.  Букринская А.Г. – Вирусология. – М.: Медицина, 1986. – 336 с., ил. С. 56 – 61.

3.  http://vivovoco.rsl.ru/VV/JOURNAL/NATURE/04_03/CHEESE.HTM

4.  http://www.pharmed.uz/3734-med.html