Актинобациллезная (гемофилезная)

вызывает у морских свинок в лёгких изменения типичные для актинобациллёзной

пневмонии. По нашему мнению, 6-8- часовые агаровые и 3- часовые бульонные

аэрируемые культуры в физиологическом отношении близки, поскольку находятся

в начальной стадии логарифмического роста. Поэтому мы считаем, что на

первом этапе развития изменений в лёгких определяющую роль играют гемолизин

и экзотоксин. По нашему мнению, 6-8- часовые агаровые культуры возбудителя

содержат не некоторое количество в связанном виде гемолизина и экзотоксина,

что определяет большую вирулентность молодых культур.

4. Патогенные свойства H.parasuis.

Исследовали чувствительность в возбудителю морских свинок, белых

мышей, поросят-отъёмышей.

ЛД50 культуры H.parasuis штамм №1 для морских свинок при

интраназальном заражении составила 354 млн.м.к., внутрибрюшинном - 594

млн.м.к., подкожном - 1,414 млд.м.к.. При всех способах заражения с

различной частотой обнаруживали развитие серозно-фибринозного плеврита,

перитонита, реже перикардита. После интраназальной инокуляции у 100%

животных отмечали развитие катаральной пневмонии. У павших животных

культуры возбудителя наиболее часто выделяли из поражённых серозных

оболочек и реже - из паренхиматозных органов.

ЛД50 культуры H.parasuis при внутрибрюшинном введении штамма серовара

С составила [pic], [pic], [pic], [pic]. Белые мыши, как и морские свинки

были более чувствительны к внутрибрюшинному (ЛД50=1,414 млрд.м.к.) и

интраназальному (ЛД50=1,549 млрд.м.к.) способам заражения при устойчивости

к подкожному введению культуры. Патологоанатомические изменения у мышей и

морских свинок были однотипны.

С нашей точки зрения, морских свинок можно рассматривать как наиболее

удобную модель для биопробы и изучения пато - и иммуногенеза инфекции,

вызываемой H.parasuis.

В опытах на поросятах-отъёмышах показано, что гемофилёзный

полисерозит может быть воспроизведён при интраназальном, трахеальном,

внутрибрюшинным и внутривенном введении культуры H.parasuis. Учитывая

экологию возбудителя, можно констатировать, что естественными входными

воротами инфекции являются дыхательные пути. При трахеальном заражении

первые клинические симптомы в виде угнетения и повышения температуры тела

отмечаются через 6-8 часов, позднее (20-24 часа) у абсолютного большинства

животных развивается катаральная пневмония. В 75% случаев уже на этой

стадии развивается серозно-фибринозный плеврит и в 50% случаев - перитонит,

что свидетельствует о высоких инвазивных свойствах возбудителя. У животных,

убитых через 24 часа после заражения, на фоне описанных

патологоанатомических изменений культуры возбудителя были выделены в 100%

случаев из лёгких и бронхиальных лимфатических узлов и в 25% случаев - из

крови. В более поздние сроки существенных изменений в характере

патологоанатомических изменений не наступало, за исключением резорбции

экссудата из полостей и появления у отдельных животных симптомов поражения

суставов конечностей и головного мозга. Гистологические исследования

(выполнены д.в.н., профессором Шубиным В.А.) позволяют охарактеризовать

изменения у экспериментально заражённых и естественно больных свиней как

септико-токсический процесс с поражением серозных покровов, паренхиматозных

органов, лимфатических узлов и центральной нервной системы.

Исследования показали, что типичные патоморфологические изменения

могут вызвать как капсулообразующие, так и бескапсульные формы возбудителя

при большей вирулентности первых.

По нашим данным изменения в лёгких, плевре, перикарде и перитонеуме

ассоциируются с локализацией в них возбудителя. Частота изоляции культур

H.parasuis из тканей и органов зависит от характера болезни и давности

процесса. При остром течении в результате экспериментального (трахеального)

заражения через 48-72 часа из лёгких культуры возбудителя выделили в 100%

случаев, плевры - 75%, перитонеума и перикарда -25%, бронхиальных

лимфатических узлов - 100%, селезёнки - 50%, крови - 25% случаев. При

бактериологическом исследовании поросят, павших с картиной острого

полисерозита, в естественных условиях культуры возбудителя выделили из

лёгких у 42,85%, перикарда - 92,2%, плевры - 71,42%, печени - 57,14%,

селезёнки - 66,66% животных. В более отдалённые сроки после

экспериментального заражения и от животных, павших в естественных условиях

с картиной подострого полисерозита, возбудитель выделяли реже и

преимущественно из плевры, лёгких, перикарда, перитонеума и средостенных

лимфоузлов.

Анализ возрастной заболеваемости поросят гемофилёзным полисерозитом

показал, что пик отхода приходится на возраст 35-60 дней. Появление отхода

поросят с явлениями гемофилёзного полисерозита совпадает со снижением титра

колостральных антител к H.parasuis (серовар Д), увеличением уровня

колонизации возбудителя в респираторном тракте. Согласно полученным данным,

H.parasuis является достаточно обычным компонентом нормальной микрофлоры

слизистых путей и на фоне описанных изменений, наряду с другими

этиологическими агентами, участвует в возникновении пневмоний у поросят

данной возрастной группы и ряде случаев это сопровождается развитием

септической стадии с поражением серозных оболочек, суставов и головного

мозга.

2.1.5.Обоснование критериев отбора материала для

бактериологического исследования на актинобациллёзную пневмонию и

гемофилёзный полисерозит.

Гемофилёзный полисерозит. Данные о диссеминации возбудителя

свидетельствуют о наибольшей частоте его выделения из поражённых серозных

оболочек, серозно-фибринозного экссудата. Выделение чистой культуры

возбудителя наиболее вероятно при исследовании пунктата из поражённых

суставов и перикарда. В замороженном патологическом материале H.parasuis

сохраняет жизнеспособность до 30 суток (режим хранения -18(С).

Актинобациллёзная плевропневмония. Независимо от характера течения

болезни возбудитель закономерно обнаруживается в поражённой ткани лёгких и

регионарных лимфатических узлах, что определяет характер материала,

отбираемого для бактериологического исследования. В патологическом

материале, заключённом в водно-глицериновую смесь ( температура хранения

4 --6(С), возбудитель сохраняет жизнеспособность в течение 15 суток, в

замороженном тканевом материале – до 45 суток.

6. Серологическая идентификация культур H.parasuis

A.pleuropneumoniae.

7. Методы и результаты серологической идентификации культур

H.parasuis.

Использовали кроличьи гипериммунные сыворотки против типовых штаммов

сероваров А, В, С, Д.

Дифференциация сероваров H.parasuis в пробирочной РА показала её

малую специфичность. Более эффективной для указанной цели оказалась РСК с

растворимыми антигенами.

Исследование в РСК с типовыми сыворотками 46 эпизоотических культур

H.parasuis, выделенных при генерализованных серозитах, позволило 47,82%

культур отнести к известным сероварам Бакоса. Штаммы серовара А составили

15,2%, В - 17,39%, С - 2,17%, Д-13,04%. В группе штаммов, выделенных из

лёгких при пневмониях (18шт), культуры серовара А составили 16,6%, В -

11,1%, С - 5,56%, Д -33,3%, нетипируемые -33,3%. В числе культур,

выделенных из носовой слизи клинически здоровых свиней (14 шт.), 35,7%

отнесены к серовару А, 14,2% -- к серовару Д, не удалось типировать 50%

штаммов.

В целом по всей группе из 78 штаммов H.parasuis было отнесено к

серовару А - 19,23%, В - 12,82%, С - 2,56%, Д - 17,95%, нетипируемые

культуры составили 47,44%.

Исследование нетипируемых культур в РСК свиноводства атисыворотками

против изоляторов этой же категории показало наличие ещё трёх

серологических вариантов и часть культур осталась за пределами этих групп.

Полученные данные позволяют заключить, что необходимо расширение числа

сероваров на базе схемы Бакоса, либо требуется создание новой схемы

серовариантной дифференциации с новыми типовыми штаммами.

Анализ серотиповой структуры культур, выделенных в пределах одного

хозяйства показал ассоциацию с генерализованными серозитами свиней

H.parasuis различной серовариантной принадлежности.

2.1.6.2. Методы и результаты серологической идентификации

культур A.pleuropneumoniae.

Для серовариантной дифференциации культур A.pleuropneumoniae

испытывали РА пробирочную, РА с 2-МЭ, РА на стекле, РНГА, РНГА с 2-МЭ, РКА

пробирочную на стекле, двухступенчатую РИФ. При внутривидовой

дифференциации в различных серологических реакциях типовых культур

A.pleuropneumoniae (серовары 1,2,3,4,5,6,7,8, 10,12) установлены

перекрёстные реакции между сероварами 3,6 и 8, 2 и 3, 1 и 2, 4 и 7.

Исследование двухсторонних антигенных связей в большинстве случаев

позволяет определить серовариантную принадлежность культур. Из группы

ускоренных серологических реакций для серологической идентификации наиболее

перспективна РКА с растворимыми антигенами.

При серологической идентификации 82 эпизоотических НАД--зависимых

культур бактерий, выделенных при фиброзно-геморрагических пневмониях свиней

и классифицированных как A.pleuropneumoniae отнесены к серовару 2 -12,9%, 3

-14,53%, 4 -8,53%, 6 -3,65%, бактериям «малой группы» -7,31%. Большую

группу штаммов серологически идентифицировать не удалось. Культуры

последней группы имели антигенное родство с сероварами 3,6,8,10, но при

исследовании в перекрёстной РА с адсорбцией были не идентичны им.

2.1.7. Результаты изучения широты распространения сероваров

A.pleuropneumoniae на основании серологических исследований.

Была предпринята попытка дать оценку циркуляции различных сероваров

A.pleuropneumoniae в свиноводческих хозяйствах одной из областей

центральной России по результатам серологических исследований. В РНГА

исследовали 639 сывороток крови свиней из десяти хозяйств. Установлено

преобладание антител к сероварам 1,4,6,3,2,12. При бактериологическом

исследовании в данном регионе культур сероваров 1 и 12 не выделяли. Причины

такой ситуации требуют дальнейшего изучения. В сыворотках крови некоторых

серопозитивных свиней удалось выявить нейтрализующие антитела к гемолизинам

A.pleuropneumoniae, что свидетельствует о наличии определённого иммунитета

к A.pleuropneumoniae.

2.1.8. Разработка и апробация ускоренных серологических методов

обнаружения антигенов A.pleuropneumoniae в патологическом материале.

Для обнаружения антигенов A.pleuropneumoniae непосредственно в

тканевом материале были испытаны реакции коагглютинации (РКА) и

двухступенчатой иммунофлуоресценции (РИФ).

Опыты показали, что РКА может быть использована для видовой и

серотиповой идентификации A.pleuropneumoniae. Серотиповую специфичность

результатов РКА удаётся повысить путём уменьшения дозы сыворотки для

сенсибилизации носителя и использования в реакции растворимых капсульных

антигенов. Более активные видовые диагностикумы удалось сконструировать при

использовании поливалентных сывороток, полученных от кроликов,

иммунизированных не моноантигенами, а смесью антигенов A.pleuropneumoniae

различных сероваров. Использование РКА как метода видовой идентификации

потребовало выяснения межвидовых антигенных связей A.pleuropneumoniae.

Изучали антигенное родство данного вида бактерий с A.suis, A.lignieresii,

P.multocida (А,В,Д), H.parasuis (A,B,C,Д), B.bronchiseptica, S.cholerasuis,

S.tiphimurium. Наиболее выраженное антигенное родство установлено с A.suis

и A.lignieresii, наличие которых в исследуемом материале может обусловить

ложноположительные результаты РКА.

Серовариантную дифференциацию типовых культур A.pleuropneumoniae

проводили в РИФ с предельными разведениями антисывороток первой ступени,

обеспечивающими свечение клеток свиноводства гомологичными реагентами на

четыре креста. Обнаружили перекрёстные реакции сероваров 1 и 2, 2,3 и 6,

3,2,6 и 8, 4 и 7, 10 и 12. Таким образом, надёжной серовариантной

дифференциации в ряде случаев добиться не удалось. Слабые перекрёстные

реакции интенсивностью на два креста получены с культурами A.suis,

A.lignieresii. Не отмечено перекрёстных реакций с P.multocida (А,В,Д),

H.parasuis (А,В,С,Д), E.coll, S.cholerasuis и S.tiphimurium.

При изучении специфичности РКА как метода обнаружения антигенов

возбудителя в органах и тканях исследовали супернатанты тканевых (лёгочных)

гомогенатов клинически здоровых свиней, морских свинок и получили

неспецифические замедленные положительные реакции. Для устранения

неспецифической аглютинации стафилококковые антительные диагностикумы

дополнительно обрабатывали нормальной кроличьей сывороткой, увеличивали

концентрацию альбумина в диагностикуме, прогревали исследуемый материал при

100(С (10,60 мин.) 120(С (15 мин.). Эффективной оказалась термическая

обработка материала. Необходимость прогревания исследуемого материала

заставила рассмотреть влияние этого фактора на антигены возбудителя.

Известно, что клетки A.pleuropneumoniae содержат специфические

термостабильные и – лабильные антигены (K.Mittal et al., 1987). Изучение

этого вопроса показало, что по термостабильности антигенов культуры можно

подразделить на группу термоустойчивых (сер.2,3,6,8,10) и термолабильных

(сер.1,7, штамм 202). У культур последней группы при кипячении (60 мин.)

снижалась активность антигенов в серологических реакциях, особенно

антигенов серовара 1 (шт.ССМ5869). Прогревание антигенов A.pleuropneumoniae

при 100(С в течении 10 минут на серологической активности антигенов

возбудителя, кроме серовара 1 не сказывается.

Возможность выявления антигенов возбудителя в тканевом материале

(лёгкие), при помощи РКА и РИФ первоначально изучали на морских свинках,

белых мышах и свиньях, заражённых культурами A.pleuropneumoniae, а также

A.suis и гемофильными бактериями «малой группы».

Результаты исследований показали совпадение данных бактериологии РИФ

и РКА. Слабые положительные реакции были получены с тканевым материалом,

содержащим A.suis.

При исследовании лёгочной ткани от 78 свиней с явлениями пневмонии из

29 материалов были выделены микоплазмы, из 15 -стафилококки или

стрептококки, изменений 16 - P.multocida, из 2 - P.multocida и гемофильные

бактерии «малой группы», из 7 - гемофильные бактерии «малой группы», из 9 -

S.cholerasuis. При наличии в патологическом материале P.multocida в двух

случаях были получены позитивные результаты РКА с диагностикумом против

штамма №202 («малая группа»), не подтверждённые данными бактериологии. В

остальных случаях при исследовании материалов, содержащих указанные выше

гетерологичные виды бактерий результаты РКА и РИФ были отрицательными. В

девяти случаях изоляции культур «малой группы» данные бактериологических

исследований, РКА и РИФ совпали.

Полученные данные позволяют оценить РКА и РИФ как достаточно

специфические и чувствительные методы обнаружения антигенов

A.pleuropneumoniae. Преимуществом РКА является возможность исследования

длительно хранившегося материала и выявления растворимых антигенов.

2.2. Разработка и испытание экспериментальных образцов

инактивированной вакцины против актинобациллёзной плевропневмонии свиней.

Возрастная заболеваемость свиней актинобациллёзной плевропневмонией

диктует необходимость вакцинации просят-отъёмышей и проблема реактогенности

препарата актуальна. Исследование остаточной токсичности инактивированных

цельноклеточных суспензий A.pleuropneumoniae в тесте прироста массы мышей

показало высокие её уровни. Из испытанных способов инактивации наиболее

эффективным оказалась обработка формальдегидом (0,2%) с последующей

выдержкой бактериальных взвесей при 4-6(С в течении 30-45 суток. Различия

сравниваемых показателей по этому препарату, а также инактивированных 0,1%

формальдегида и тиомерсалом были достоверны, на уровне значимости от Р(0,01

– до Р(0,05 (в зависимости от сроков хранения). Полученные данные были

учтены в технологии изготовления инактивированной эмульгированной вакцины.

Испытание вакцины такого типа на 21,38 – 40 - дневных поросятах и

супоросных свиноматках показало её безвредность.

В качестве лабораторных моделей для испытания специфической

активности инактивированной вакцины были испытаны морские свинки живой

массой 200—250г и белые мыши живой массой 14-16г. Мышей вакцинировали

подкожно, двукратно с интервалом 10 суток в дозе [pic] с последующим

определением ЛД50 заражающей культуры на вакцинированных и контрольных

животных («внутрибрюшинная модель»). ЛД50 культуры, установленная на

вакцинированных животных пятикратно, превышала тот же показатель,

полученный на контрольных животных.

Морских свинок акционировали однократно различными дозами вакцины с

последующим интраназальном заражении гомологичной культурой в дозе [pic]

(«лёгочная модель»). Подобный методический подход позволил определить ИМД50

вакцины. По нашему мнению, «лёгочная модель» предпочтительнее, поскольку

этот метод соответствует естественным входным воротам возбудителя инфекции.

С другой стороны, об эффективности иммунизации можно дополнительно судить

по наличию поражений в лёгких их массивности. Определённую информацию дают

показатели серологического ответа - между объёмом поражённой лёгочной ткани

и среднегрупповыми титрами антител (РСК) установлена функциональная

обратная зависимость [pic]

Исследовали влияние типа адъюванта на иммунологическую эффективность

инактивированной вакцины. В качестве адъювантов использовали гидрат окиси

алюминия и масляный адъювант на основе лёгкого минерального масла.

Эмульгированной вакциной привили 315 поросят (полсектора) в неблагополучном

по актинобациллёзной плевропневмонии хозяйстве, 317 свиней этого же сектора

служили контролем. Гидроокись -алюминиевую вакцину ввели 647 поросятам,

контролем служили 652 животных. Наблюдение за животными вели в течении 86

дней, заболевание свиней актинобациллёзной плевропневмонией наблюдали во

всех группах. Индекс и коэффициент эффективности эмульгированной вакцины в

этом опыте составил соответственно 7,95 и 8,42%. Аналогичные показатели в

группе свиней привитых РОА вакциной были соответственно 3,12 и 67,98%, что

свидетельствует о большей эффективности эмульгированной вакцины.

При конструировании инактивированной вакцины, исходя из полученных данных о

накоплении в культуральной жидкости экзотоксина, гемолизина и капсульной

субстанции, исследовали влияние растворимых антигенов бульонных культур на

её иммуногенность. В опыте на белых была определена ИМД50 эмульгированной

вакцины приготовленной на основе бульонных культур и отмытых клетках

возбудителя. ИМД50 вакцины первого типа составила [pic] микробных клеток, у

вакцины второго типа ИМД50 не удалось рассчитать, так как процент защиты

при избранных дозах вакцины не превысил 36,36%. Следовательно, включение

Страницы: 1, 2, 3, 4