Генная инженерия

большой работы со стороны генной инженерии, в плане подборов необходимых

штаммов и созданию генно-инженерных конструкций, которые дают наибольший

эффект для конкретных классов насекомых. Кроме видоспецифичности по

действию на насекомых встраивание прокариотических генов дельта-токсинов в

геном растений даже под контролем сильных эукариотических промоторов не

привело к высокому уровню экспрессии. Предположительно такое явление

возникло в связи с тем, что эти бактериальные гены содержат значительно

больше адениновых и тиминовых нуклеатидных оснований, чем растительная ДНК.

Эта проблдема была решена путем создания модефицированных генов, где один

из природного гена вырезали и добавили те или иные фрагменты с сохранением

доменов, кодирующих активные части дельта-токсинов. Так, например, с

помощью таких подходов был получен картофель, устойчивый к колорадскому

жуку. В настоящее время так называемый Bt – растения хлопка и кукурузы

занимают основную долю в общем объеме генетически модифицированных растений

этих культур, которые выращивают на полях США.

3.1.1 Изменение свойств сельскохозяйственных технических растений

Современная биотехнология в состоянии манипулировать многими важнейшими

признаками, которые можно разделить на три группы:

1. Сельскохозяйственные производства. К ним можно отнести общей

продуктивности растений за счет регулирования синтеза фитогормонов

или дополнительного снабжения кислородом растительных клеток, а

также признаки обеспечивающие устойчивость к разного рода

вредителям, кроме этого в создании форм растений с мужской

стерильностью и возможностью дольше сберегать урожай.

2. К признакам которые влияют на качество продукции, относится

возможность манипулировать молекулярным весом жирных кислот.

Растения будут производить биодеградирующий пластик, по цене

сопоставимой с полиэтиленом, получаемым из нефти. Открылась

возможность получения крахмала с заданными физико-химическими

свойствами. Аминокислотный состав у растений запасных белков

становится более сбалансированным и легко усвояем для млекопитающих.

Растения становятся продуцентами вакцин, фармакологических белков и

антител, что позволяет удешевить увеличение разных заболеваний, в

том числе и онкологических. Получены и испытываются трансгенные

растения хлопка с уже окрашенным волокном, более высоким качеством.

3.1.2. Генетическая модификация пластид.

Во многих случаях генетической модификации будут подвергаться не

ядерные геномы, а геномопластит или метохондрия. Такие системы позволяю

значительно увеличить содержание продукта в трансгенном материале.

В генной инженерии исследуются следующие направления:

- Управляемая активность генов;

- Селективная экспрессия трансгена в определенных тканях;

- Система экспрессии растения в чужеродной генетической

информации, опосредованной вирусами.

Разработанная усилиями компании “Biosource” (США) технология позволяет

быстро и в больших количествах нарабатывать в растениях белки и небольшие

молекулы за счет инфицирования растений генетически модифицированными

вирусами, со встроенными чужеродными генами тех или иных белков. За этой

системой большое будущее так как она позволяет изменить биосинтетические

процессы в растениях без длительных и дорогостоящих манипуляций с

растительным геномом.

3.3. ГЕННЫЕ ВАКЦИНЫ

3.2.1. Актуальность разработки новых вакцин

Вакцины — одно из самых значительных достижений медицины, их

использование к тому же чрезвычайно эффективно с экономической точки

зрения. В последние годы разработке вакцин стали уделять особое внимание.

Это обусловлено тем, что до настоящего времени не удалось получить

высокоэффективные вакцины для предупреждения многих распространенных или

опасных инфекционных заболеваний. По данным созданной в прошлом году

международной организации «Всемирный союз по вакцинам и иммунизации» (в

числе ее участников — ВОЗ, ЮНИСЕФ, Международная федерация ассоциаций

производителей фармацевтической продукции, Программа Билла и Мелинды Гейтс

по вакцинации детей, Рокфеллеровский фонд и др.), в настоящее время

отсутствуют эффективные вакцины, способные предупредить развитие СПИДа,

туберкулеза и малярии, от которых в 1998 г. умерло около 5 млн человек.

Кроме того, увеличилась заболеваемость, обусловленная теми инфекциями, с

которыми человечество ранее успешно боролось. Этому способствовало

появление лекарственно-устойчивых форм микроорганизмов, увеличение числа

ВИЧ-инфицированных пациентов с иммунной недостаточностью, ослабление систем

здравоохранения в странах с переходной экономикой, увеличение миграции

населения, региональные конфликты и др. При этом распространение

микроорганизмов, устойчивых к воздействию антибактериальных препаратов,

приобрело характер экологической катастрофы и поставило под угрозу

эффективность лечения многих тяжелых заболеваний. Повышенный интерес к

вакцинам возник после того, как была установлена роль патогенных

микроорганизмов в развитии тех заболеваний, которые ранее не считали

инфекционными. Например, гастриты, пептическая язва желудка и

двенадцатиперстной кишки, ассоциированная с H. pylori, злокачественные

новообразования печени (вирусы гепатита В и С).

Поэтому в последние 10–15 лет правительства многих стран стали

принимать меры, направленные на интенсивную разработку и производство

принципиально новых вакцин. Например, в США в 1986 г. был принят закон

(«National Vaccine Injury Compensation Act»), защищающий производителей

вакцин от юридической ответственности при подаче судебных исков, связанных

с развитием побочных реакций при вакцинации, если они не были обусловлены

ошибками при производстве вакцины. С изменением ситуации увеличился и

мировой рынок вакцин, объем продаж которого в 1998 г. составил 4 млрд

долларов США в стоимостном выражении. Однако многие считают, что в

ближайшие годы этот сектор фармацевтической промышленности будет

развиваться гораздо быстрее. Так, согласно публикациям в американском

журнале «Signals Magazine» (январь 1999 г.), который освещает ситуацию в

современной биотехнологической промышленности, объем продаж вакцин на

мировом рынке через 10 лет составит 20 млрд долларов США. Этот прогноз

принадлежит М. Греко, исполнительному директору компании «Merieux MSD»,

совместного предприятия крупнейших производителей вакцин — компаний

«Pasteur Merieux Connaught» (теперь «Aventis Pasteur») и «Merck & Co.».

3.2.2.Разработка ДНК-вакцин

Используемые сегодня вакцины можно разделить в зависимости от методов

их получения на следующие типы:

• живые аттенуированные вакцины;

• инактивированные вакцины;

• вакцины, содержащие очищенные компоненты микроорганизмов (протеины или

полисахариды);

• рекомбинантные вакцины, содержащие компоненты микроорганизмов, полученные

методом генной инженерии.

Технологию рекомбинантной ДНК применяют также для создания живых

ослабленных вакцин нового типа, достигая аттенуации путем направленных

мутаций генов, кодирующих вирулентные протеины возбудителя заболевания. Эту

же технологию используют и для получения живых рекомбинантных вакцин,

встраивая гены, кодирующие иммуногенные протеины, в живые непатогенные

вирусы или бактерии (векторы), которые и вводят человеку.

|[pic] |

|Рис. 5. Одноразовый генный пистолет компании |

|«Powderject» |

|а — внешний вид; б — в разрезе |

| |

В 1990 г. в некоторых исследовательских лабораториях приступили к

разработке новых вакцин, которые основаны на введении «голой» молекулы ДНК.

Уже в 1992–1993 гг. несколько независимых групп исследователей в результате

эксперимента доказали, что введение чужеродной ДНК в организм животного

способствует формированию иммунитета.

Принцип применения ДНК-вакцин заключается в том, что в организм

пациента вводят молекулу ДНК, содержащую гены, кодирующие иммуногенные

белки патогенного микроорганизма. ДНК-вакцины называют еще генными,

генетическими, полинуклеотидными вакцинами, вакцинами из нуклеиновых

кислот. На совещании специалистов по генным вакцинам, проведенном в 1994 г.

под эгидой ВОЗ, было решено отдать предпочтение термину «вакцины из

нуклеиновых кислот» с их подразделением соответственно на ДНК- и РНК-

вакцины. Такое решение основывалось на том, что употребление термина «ДНК-

вакцина» не сформирует ошибочное мнение о том, что новые вакцины вносят

изменения в генетические структуры организма вакцинируемого человека. Тем

не менее, многие специалисты считают более точным термин «генные вакцины»

(поскольку иммунная реакция направлена не против ДНК, а против антигенного

белка, кодируемого геном), который также часто применяют.

Для получения ДНК-вакцин ген, кодирующий продукцию иммуногенного

протеина какого-либо микроорганизма, встраивают в бактериальную плазмиду.

Плазмида представляет собой небольшую стабильную молекулу кольцевой

двухцепочечной ДНК, которая способна к репликации (воспроизведению) в

бактериальной клетке. Кроме гена, кодирующего вакцинирующий протеин, в

плазмиду встраивают генетические элементы, которые необходимы для

экспрессии («включения») этого гена в клетках эукариотов, в том числе

человека, для обеспечения синтеза белка. Такую плазмиду вводят в культуру

бактериальных клеток, чтобы получить большое количество копий. Затем

плазмидную ДНК выделяют из бактерий, очищают от других молекул ДНК и

примесей. Очищенная молекула ДНК и служит вакциной. Введение ДНК-вакцины

обеспечивает синтез чужеродных протеинов клетками вакцинируемого организма,

что приводит к последующей выработке иммунитета против соответствующего

возбудителя. При этом плазмиды, содержащие соответствующий ген, не

встраиваются в ДНК хромосом человека.

ДНК-вакцины можно вводить в солевом растворе обычным парентеральным

способом (внутримышечно, внутрикожно). При этом бoльшая часть ДНК поступает

в межклеточное пространство и только после этого включается в клетки.

Применяют и другой метод введения, используя так называемый генный пистолет

(рис. 5, 6). Для этого ДНК фиксируют на микроскопических золотых гранулах

(около 1–2 мкм), затем с помощью устройства, приводимого в действие сжатым

гелием, гранулы «выстреливают» непосредственно внутрь клеток. Следует

отметить, что аналогичный принцип введения лекарства с помощью струи

сжатого гелия используют и для разработки новых способов доставки

лекарственных средств (с этой целью оптимизируют размеры частиц

лекарственного вещества и их плотность для достижения необходимой глубины

проникновения в соответствующую ткань организма). Этот метод требует очень

небольшого количества ДНК для иммунизации. Если при иммунизации

классическими субъединичными вакцинами вводят микрограммы протеина, то при

использовании ДНК-вакцины — нанограммы и даже меньше. Говоря о минимальном

количестве ДНК, достаточном для индукции иммунного ответа, С.А. Джонстон,

директор Центра биомедицинских изобретений Техасского университета, в

журнале «The Scientist» (1998) отмечает, что с помощью генного пистолета

можно однократно ввести мыши «фактически 27 тыс. различных плазмид и

получить иммунный ответ на индивидуальную плазмиду».

|[pic] |

|Рис. 6. Многоразовый генный пистолет компании |

|«Powderject» |

|а — сменный картридж; б — прибор в полной сборке |

| |

Последующие эксперименты подтвердили способность ДНК-вакцин формировать

иммунитет в отношении разнообразных возбудителей.

Потенциальные преимущества ДНК-вакцин

ДНК-вакцины обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционными

вакцинами.

3.2.3. Повышение эффективности и безопасности иммунизации

1. Способствуют выработке антител к нативной молекуле вирусных

протеинов.

Если в качестве вакцины использовать иммуногенные протеины, то в

процессе их производственного получения и очистки могут произойти изменения

трехмерной конфигурации этих молекул. Поэтому иммунизация может быть

низкоэффективной в связи с образованием антител, специфичных к измененным

иммуногенным молекулам, но не к нативным вирусным протеинам. Введение ДНК-

вакцин, как правило (см. «возможные ограничения в применении ДНК-вакцин»),

приводит к синтезу клетками вирусных антигенов в их нативной форме.

2. Способствуют выработке цитотоксических Т-лимфоцитов.

Инактивированные или субъединичные вакцины в основном индуцируют

гуморальный иммунный ответ. Это обусловлено тем, что характер механизмов

представления и распознавания антигенов клетками иммунной системы зависит

от того, синтезируется ли антиген в клетке или поступает в нее извне. А от

этого в свою очередь зависит характер активации и взаимодействия клеток,

участвующих в иммунном ответе. Поскольку ДНК-вакцины обеспечивают синтез

иммунногенных белков клетками самого организма, они способствуют

формированию как гуморального, так и клеточного иммунитета. Активация

цитотоксических Т-клеток без введения живого патогена является важнейшей

отличительной чертой ДНК-вакцин.

3. Могут избирательно воздействовать на различные субпопуляции Т-

лимфоцитов.

В принципе возможна разработка ДНК-вакцин, которые избирательно

активируют разные типы хелперных Т-лимфоцитов. Благодаря этому могут быть

созданы генные вакцины для лечения лиц с аутоиммунными или аллергическими

заболеваниями, патогенез которых связан с нарушением различных звеньев

иммунной регуляции.

4. Способствуют формированию длительного иммунитета.

Как и живые аттенуированные, ДНК-вакцины способны обеспечивать

иммунитет в течение длительного времени. Этим они отличаются от

инактивированных вакцин, которые обеспечивают длительный иммунитет только

путем проведения повторных вакцинаций.

5. Устраняют риск инфицирования.

По своему действию ДНК-вакцины напоминают живые аттенуированные

вирусные вакцины или некоторые рекомбинантные вакцины на основе живых

вирусных векторов, так как иммуногенные белки синтезируются в организме

самого человека. Но при введении генных вакцин отсутствует опасность

инфицирования человека.

3.2.4. Упрощение разработки и производства новых вакцин

1. Простота получения большого количества ДНК-патогенных

микроорганизмов.

Многие микроорганизмы сложно культивировать (вирусы гепатита В и С,

папилломы человека и др.), что затрудняет создание вакцин. Благодаря

современным технологиям (например, применение полимеразной цепной реакции)

можно получить достаточное количество ДНК практически любого патогенного

микроорганизма, выделить гены, кодирующие иммуногенные протеины, и создать

вакцину. Выполнение Проекта человеческого генома приведет к тому, что через

несколько лет ученые будут располагать расшифрованными геномами большинства

известных патогенных микроорганизмов. Это значительно облегчит задачу

скрининга генов для идентификации тех из них, которые кодируют молекулы

иммуногенных протеинов возбудителя заболевания. В тех случаях, когда такие

гены трудно выявить, разработчики вакцин могут воспользоваться

«библиотеками ДНК» соответствующих патогенов (коллекциями

последовательностей комплементарной ДНК, содержащими только те участки ДНК

какого-либо микроорганизма, которые кодируют продукцию белков, то есть все

экспрессированные гены). Эти молекулы ДНК легко клонировать и использовать

в исследованиях по созданию вакцин.

2. Возможность создания комбинированных вакцин.

В качестве комбинированных вакцин сейчас широко применяют только

инактивированные вакцины, поскольку при введении нескольких аттенуированных

вирусных вакцин они могут терять иммуногенность (так называемый феномен

вирусной интерференции). ДНК-вакцины можно комбинировать. Это особенно

важно, так как в настоящее время детям с 1-й недели жизни и до 16–18 лет

выполняют не менее 18 вакцинаций. Мультивалентные ДНК-вакцины можно

использовать для выработки эффективного иммунитета против паразитарных

заболеваний (так как антигенные характеристики паразита могут зависеть от

стадии его развития в организме человека), а также для борьбы с

лекарственно-устойчивыми формами микроорганизмов.

3. Упрощение производства вакцин.

Технологии производства большинства применяемых сегодня вакцин

чрезвычайно разнообразны и во многом зависят от особенностей возбудителя

заболевания, против которого разработана вакцина. Напротив, технология

получения различных ДНК-вакцин существенно не отличается. ДНК-вакцины

отличаются только генами, которые включены в плазмиду. Генные вакцины можно

отнести к субъединичным вакцинам, поскольку они приводят к синтезу одного

или нескольких иммуногенных белков в организме человека. Однако методы

создания «классических» субъединичных вакцин, как и рекомбинантных

субъединичных вакцин на основе применения вирусных векторов, значительно

сложнее. Использование единой технологии может существенно упростить

стандартизацию методов производства ДНК-вакцин и контроля их качества.

Кроме того, это позволит сократить затраты на их производство.

3.2.5. Упрощение требований к условиям хранения

1. Высокая стабильность вакцин.

ДНК-вакцины высокостабильны. Они способны выдерживать низкие и высокие

температуры (немногим ниже температуры кипения воды) и разные условия

влажности. Поэтому генные вакцины не требуют создания так называемых

холодовых цепочек (необходимость хранения вакцин в холодильных установках

на всем пути от места производства до конечного потребителя). Это качество

дает им значительные преимущества перед другими вакцинами, так как в

некоторых развивающихся странах на поддержание холодовых цепочек приходится

около 80% стоимости проведения одной вакцинации. Таким образом, стоимость

транспортировки и хранения ДНК-вакцин будет значительно ниже.

Возможные ограничения в применении ДНК-вакцин

Поскольку гены кодируют синтез белковых молекул, то ДНК-вакцины

способствуют формированию иммунитета только в отношении протеиновых

компонентов болезнетворных микроорганизмов. Поэтому они не могут заменить

вакцины, действие которых основано на использовании других антигенных

молекул, например капсулярных антигенов, представленных полисахаридами

(полисахаридные пневмококковые, менингококковые, брюшнотифозные вакцины и

др.).

Другое ограничение связано с тем, что молекулы белков после синтеза

часто претерпевают в клетке дальнейшие биохимические изменения, например

подвергаются гликозилированию. Эти процессы в клетках человека, животных и

микроорганизмов могут протекать по-разному. Поэтому существует вероятность

Страницы: 1, 2, 3, 4